蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定（精制資料）

1、第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定第一節(jié) 概述,一. 蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。人體內(nèi)的酸堿平衡、水平衡的維持、遺傳信息的傳遞、物質(zhì)的代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。人及動(dòng)物只能從食品得到蛋白質(zhì)及其分解物，來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，故蛋白質(zhì)是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是是食品的重要組成之一。一個(gè)食品的營(yíng)養(yǎng)高低，主要看蛋白質(zhì)含量的高低。蛋白質(zhì)除了保證食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，在決定食品的色、香、味及結(jié)構(gòu)等特征上也起著重要的作用。,1,嚴(yán)選課件,（一）蛋白質(zhì)組成與分類 1. 組成Composition 蛋白質(zhì)是復(fù)雜的

2、含氮有機(jī)化合物，它的溶液是典型的膠體分散體系，由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要組成元素是C 、H、O、N、S、P。另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，它的組成和結(jié)構(gòu)不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的蛋白質(zhì)的元素組成百分比。 元素組成百分比：元素 C H O N S P 百分比 50 7 23 16 0-3 0-3 一般來說，蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，所以在用凱氏定氮法定量蛋白質(zhì)時(shí)，將測(cè)得的總氮%乘上蛋白質(zhì)的換算參數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量。,2,嚴(yán)選課件,2.按蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可將蛋白質(zhì)分為以下三類： 完全蛋白質(zhì)：這是一種質(zhì)量?jī)?yōu)良的蛋

3、白質(zhì)，含有人體必需氨基酸，并且所含種類齊全，數(shù)量充足，比例合適，不但能夠維持人的生命與健康，而且能促進(jìn)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育。如奶類中的酪蛋白、大豆蛋白及小麥中的麥谷蛋白等，都是人體所必須的完全蛋白質(zhì)。 半完全蛋白質(zhì)：此類蛋白質(zhì)中，所含必需氨基酸種類比較齊全，但含量低，相互間的比例又不合適。如果在膳食中以它作為唯一的蛋白質(zhì)來源，可以維持生命，但不能促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。例如大麥、小麥中的麥膠蛋白。,3,嚴(yán)選課件,不完全蛋白質(zhì)：這類蛋白質(zhì)中所含必需氨基酸的種類不全，如果在膳食中把它作為唯一的蛋白質(zhì)來源，既不能促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，也難以維持生命。例如玉米中的玉米膠蛋白、豌豆中的豆球蛋白，動(dòng)物結(jié)締組織和肉皮

4、中的膠原蛋白等。 3.食品中蛋白質(zhì)的氨基酸組成 上面我們已講了蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，按照-氨基酸側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)可分為：,4,嚴(yán)選課件,脂肪族類：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。 羥基類：絲氨酸、蘇氨酸 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 堿性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸 酰胺類：天冬酰胺、谷氨酰胺 含硫類：半胱氨酸、蛋氨酸 芳香族類：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 亞氨基酸：脯氨酸,5,嚴(yán)選課件,在構(gòu)成構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人

5、體中不能合成，必須依靠從食品攝入，故被稱為必需氨基酸，它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能。 限制氨基酸：是指食物蛋白質(zhì)中一種或幾種必需氨基酸缺少或數(shù)量不足，就會(huì)使食物蛋白質(zhì)合成為機(jī)體蛋白質(zhì)的過程受到限制，亦即限制了此種蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這類氨基酸就稱為。,6,嚴(yán)選課件,按易缺少數(shù)量多少的順序排列，稱為第一限制氨基酸、第二等等。如大豆第一限制氨基酸為蛋氨酸。大米第一限制氨基酸為lys，第二限制氨基酸為thr. 評(píng)價(jià)某種蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值包括兩個(gè)方面：一是各種必需氨基酸含量是否豐富，二是必需氨基酸的構(gòu)成是否符合一定比例。,7,嚴(yán)選課件,（二）各種食品中蛋白質(zhì)的含量及測(cè)定意義 1.含量 由于食品種類很多

6、，所以蛋白質(zhì)含量分布是不均勻的，一般動(dòng)物組織蛋白質(zhì)含量高于植物組織，而且動(dòng)物組織以肌肉內(nèi)臟含量較多于其他部分，植物是以種子含量高，豆類含蛋白質(zhì)最高。 如黃豆蛋白質(zhì)含量在40%。 牛肉中蛋白質(zhì)含量為 20.0%左右， 豬肉 9.5%， 兔肉 21%， 雞肉 20% ， 牛乳 3.5%， 帶魚 18.0%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黃瓜 1.0%， 蘋果 1.4%,8,嚴(yán)選課件,2.測(cè)定意義 測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有及其重要的意義。 蛋白質(zhì) 是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量高低的指標(biāo)，還關(guān)系到人體健

7、康。如果膳食中蛋白質(zhì)長(zhǎng)期不足，將出現(xiàn)負(fù)氮平衡，也就是說每天體內(nèi)的排出氮大于抗體攝入氮，這樣造成消化吸收不良導(dǎo)致腹瀉等。但是攝入量過多會(huì)引起機(jī)體肝、腎病變。,9,嚴(yán)選課件,二.蛋白質(zhì)的測(cè)定方法 蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即利用含氮量，肽鍵等測(cè)定蛋白質(zhì)含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 但是食品種類很多，食品中蛋白質(zhì)含量又不同，特別是其他成分如碳水化合物，脂肪和維生素等干擾成分很多，故蛋白質(zhì)的測(cè)定最常用的方法是凱氏定氮法。它是測(cè)定總有機(jī)氮的最準(zhǔn)確和操作較簡(jiǎn)便的方法之一，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。由于食品中蛋白質(zhì)含量不同又分為凱氏定氮常

8、量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。,10,嚴(yán)選課件,鑒于食品中氨基酸成分的復(fù)雜性，在一般的常規(guī)檢驗(yàn)中多測(cè)定樣品中的氨基酸總量，通常采用酸堿滴定法測(cè)定。 色譜技術(shù)的發(fā)展則為各種氨基酸的分離、鑒定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出現(xiàn)多種氨基酸分析儀，這使得快速鑒定和定量氨基酸的理想成為現(xiàn)實(shí)。另外利用近紅外反射分析儀，輸入各類氨基的軟件，通過電腦控制進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)和計(jì)算，也可以快速、準(zhǔn)確的測(cè)出各種氨基酸含量。下面分別介紹常用的蛋白質(zhì)和氨基酸測(cè)定方法。,11,嚴(yán)選課件,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定關(guān)于氮-蛋白質(zhì)換算系數(shù) 對(duì)于氮含量換算成蛋白質(zhì)含量的系數(shù)，歷來采用6.25，這個(gè)數(shù)值是以蛋

9、白質(zhì)平均含氮而導(dǎo)出的數(shù)值，但是食品中含氮的比例，因食品種類不同，差別是很大的，我們?cè)跍y(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)，一般手冊(cè)上列出了一部分換算系數(shù)，用時(shí)可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70，如果手冊(cè)上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫報(bào)告時(shí)要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。 對(duì)于用各種原料混合制成的食品，采用占總氮量多的原料為換算系數(shù)，對(duì)于一些組成成分不明確的食品可采用6.25，我們?cè)谧鲗?shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)，一定要注明所用的換算系數(shù)。,12,嚴(yán)選課件,一、凱氏定氮法 由Kield

10、hl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法,可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。這里只介紹前三種。 （一）常量凱氏定氮法 1. 原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。,13,嚴(yán)選課件,整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定 消化 總反應(yīng)式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用濃硫酸（98

11、%），濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。 濃硫酸又有氧化性，將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸被還原為二氧化硫： 2H2SO4 +CCO2+2SO2+2H2O 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。 在消化反應(yīng)中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)：,14,嚴(yán)選課件,加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸沸點(diǎn) 340，加入硫酸鉀（1689 ）之后可以提高至400以上。原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷的被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故

12、沸點(diǎn)升高，其反應(yīng)式如下： K2SO4 +H2SO4 =2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O+SO3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失： （NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO4,15,嚴(yán)選課件,2（NH4）HSO4 NH3+SO3+H2O 也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時(shí)堿性指示劑）。硫酸銅的作用機(jī)理如下： C+ 2CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+22SO4 2CuSO4 +SO2+2H2O,16,嚴(yán)選課件,此反應(yīng)不斷進(jìn)

13、行，待有機(jī)物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅生成（褐色），溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，以及下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。除硫酸銅外還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦等，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī) 物氧化速度。但要防止氨進(jìn)一步氧化為氮。一般說來，若有足夠的其他還原劑，如碳，則添加氧化劑不致使測(cè)定結(jié)果偏低。目前使用雙氧水較多，但必須注意須待消化液完全冷卻后再加入。,17,嚴(yán)選課件,儀器：凱氏消化裝置。100頁 要防止爆沸。 幻燈片 21,18,嚴(yán)選課件,2. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸

14、餾，放出氨氣。幻燈片 22,19,嚴(yán)選課件,3. 吸收與滴定 用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑，國(guó)標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅）。 指示劑 紫紅色 綠色 淡紫紅 （酸） （堿） （酸） 用過量的 H2SO4 或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。（pH4.86.0 紅 黃 ）,吸收,滴定,20,嚴(yán)選課件,操作步驟： 準(zhǔn)確稱取固體樣品0.20-2.00g（半固體25g，液體樣品1020ml）于500ml凱氏瓶中加10g無水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4輕輕搖勻后連接消化裝置，在通風(fēng)櫥中先以

15、小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中繼續(xù)消化至到樣液呈藍(lán)綠色透明時(shí)再消化30分鐘，停止消化，冷卻加200ml水幻燈片 18,21,嚴(yán)選課件,連接蒸餾裝置用硼酸作吸收液在K氏燒瓶中加玻璃珠數(shù)粒和80ml40% NaOH搖動(dòng)凱氏瓶至瓶?jī)?nèi)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀，再加入100ml蒸餾水，夾緊夾子加熱蒸餾至氨全部蒸出（餾出液約250ml即可），將冷凝管下端提離液面，用蒸餾水沖洗管口，繼續(xù)蒸餾1分鐘，以奈氏試劑檢查餾出液，如無紅棕色物生成，則蒸餾完畢，可停止加熱用0.1M HCl滴定至藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為終點(diǎn)。 2. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉

16、加熱蒸餾，放出氨氣。,22,嚴(yán)選課件,奈氏試劑Nessler試劑，K2（HgI4） 檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析 出黃色或紅棕色沉淀。 配制 方法1- 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時(shí)過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。 方法2- 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲(chǔ)存于棕色瓶中。,23,嚴(yán)選課件,下面針對(duì)幾點(diǎn)來說明影響氨化完全和速度快的因素 （1）K氏燒瓶和取樣量 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800100

17、0ml的更好，這樣的K氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。 （2）分解劑 A H2SO4和K2SO4的添加量 有機(jī)物分解需要的H2SO4量應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。,24,嚴(yán)選課件,K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g樣品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的 還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10g：20ml B 催化劑 用作催化劑的有Hg、HgO、Se、CuSO4、TiO2，對(duì)Hg，HgO有毒但

18、效果好，Se與CuSO4效果相似，TiO2的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。,25,嚴(yán)選課件,（3）熱源的強(qiáng)度 消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大，即便K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強(qiáng)導(dǎo)致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏燒瓶的容量大小，頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等，也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。,26,嚴(yán)選課件,（4）氨的蒸餾和吸收及滴定 蒸餾加NaOH是40%，加的量為H2SO4量的3倍，硫酸量為20ml，則NaOH為203=60ml，而且一般高于這

19、個(gè)理論值，即加到7080ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。 吸收液有：1標(biāo)準(zhǔn)H2SO4 用標(biāo)準(zhǔn)堿反滴定，甲基紅指示劑 2 硼酸 用HCl進(jìn)行滴定，混合指示劑 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)起見一般用4%。,27,嚴(yán)選課件,結(jié)果計(jì)算：101頁 注意：F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為 6.25 也可查表。 說明： 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮

20、化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。 消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。,28,嚴(yán)選課件, 樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。,29,嚴(yán)選課件, 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣

21、品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時(shí)發(fā)黑。 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。,30,嚴(yán)選課件,二、微量凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點(diǎn)： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 凱氏燒瓶100ml 可用微量滴定管。 3、蒸餾裝置見 102

22、頁圖 5-9 。,31,嚴(yán)選課件,10-2,5-9,32,嚴(yán)選課件,4.說明： 蒸餾前給水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測(cè)定結(jié)果。 蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程不得?；饠嗥?，否則將發(fā)生倒吸。 加堿要足量，操作要迅速；漏斗應(yīng)采用水封措施，以免氨由此逸出損失。 2硼酸吸收液每次用量為25ml，用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2滴。,33,嚴(yán)選課件,三、自動(dòng)凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、特點(diǎn)： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘

23、可消化完畢。 （3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。,34,嚴(yán)選課件,35,嚴(yán)選課件,半自動(dòng)凱氏定氮儀,36,嚴(yán)選課件,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但除自動(dòng)凱氏定氮法外，均操作費(fèi)時(shí)，且有環(huán)境污染，影響操作人員健康。 為滿足生產(chǎn)單位對(duì)工藝過程的快速控制分析，盡量減少環(huán)境污染和操作簡(jiǎn)便省時(shí)，因此又陸續(xù)創(chuàng)立了不少快速測(cè)定法。 包括雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。,37,嚴(yán)選課件,一.雙縮脲法 1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時(shí)

24、，兩分子縮和成雙縮脲。,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)和物，此反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（ CONH），與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測(cè)其吸光度，確定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,38,嚴(yán)選課件,注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化,2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。 3.主要儀器： 分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000 r/

25、m in） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液,39,嚴(yán)選課件,甘油作為穩(wěn)定劑：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入50ml4%CuSO4。 酒石酸鈉作穩(wěn)定劑，吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。 (2) 四氯化碳,40,嚴(yán)選課件,5操作方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱0.6g樣品使用試劑 準(zhǔn)確稱0.5g樣品使用試劑 假如用試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品為

26、標(biāo)樣，根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量，取離心澄清液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中分別加水定容，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。 以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以上述吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,41,嚴(yán)選課件,（2）準(zhǔn)確稱樣0.5g于80ml離心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑蓋上蓋子離心10min（4000轉(zhuǎn)/分）放置1小時(shí)吸混合液15ml于20ml離心管中離心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)含量。,42,嚴(yán)選課件,4 計(jì)算：蛋白質(zhì)%=（C/W）100 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得蛋白質(zhì)含量（mg） W-

27、測(cè)定樣液時(shí)相當(dāng)于樣品重量（mg） 三紫外吸收法 1原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，,在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質(zhì)濃度（38mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并參照事先用凱氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。,43,嚴(yán)選課件,2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。 3主要儀器： 紫外分光光度計(jì) 離心機(jī)（3000 5000 r/min） 4操作：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用

28、四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每分鐘30005000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸取上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶鐘，每個(gè)容量瓶各加入8mol/l脲的氫氧化鈉溶液至標(biāo)線，充分搖2分鐘（如果混濁再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。（做參比值）,44,嚴(yán)選課件,以事先用凱氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，上述的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取試樣1.00g于50ml燒杯中加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml攪拌10分鐘四層紗布過濾到離心管中用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測(cè)吸

29、光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)的含量。 計(jì)算： 蛋白質(zhì)= （C/W）100 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（mg） W-測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（mg） 說明：a.此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性蛋白質(zhì)樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。b.溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在2030。,45,嚴(yán)選課件,四.水揚(yáng)酸比色法： 1.原理： 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有藍(lán)色的化合物，可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。 2.方法 （）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6

30、分別加空白酸液 2ml 分別加磷酸鹽緩沖液 5ml 稀釋至總體體積至 15ml 分別加水揚(yáng)酸鈉 5ml 37C水浴 15分鐘 加入次氯酸鈉 2.5ml 37C水浴 15分鐘 取出加水至標(biāo)線，于660nm下進(jìn)行比色測(cè)定，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線,46,嚴(yán)選課件,（2）樣品處理： 準(zhǔn)確稱樣0.201.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化直到出現(xiàn)暗綠色時(shí)搖動(dòng)瓶子K氏瓶全部消化后冷卻加水至250ml容量瓶。 （3）樣品測(cè)定： 準(zhǔn)確吸取上述消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容準(zhǔn)確吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸緩沖液以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同 并以試劑空白微對(duì)

31、照，測(cè)得樣液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。 （4）計(jì)算 CF 含氮%= - 100 W10001000 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定樣液的含氮量（g） F-樣品溶液的稀釋倍數(shù) W-樣品重量（g） 蛋白質(zhì)%=總氮%K（K可為6.25，也可查）,47,嚴(yán)選課件,第四節(jié) 氨基酸總量測(cè)定 蛋白質(zhì)經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的蛋白質(zhì)成分， 如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨、肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成 蛋白質(zhì)最基本的物質(zhì)。 水解后的蛋白質(zhì)和水解前的蛋白質(zhì)在物理特性，化學(xué)結(jié) 構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的 程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程 度，也就可以評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 氨

32、基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測(cè) 定出17種氨基酸（儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用），對(duì)于食 品來說有時(shí)有很多種氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，,48,嚴(yán)選課件,所以需要測(cè)定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸 百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基 酸態(tài)氮）的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含 有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含 氮量計(jì)算出氨基酸的含量。 食品在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)，除了測(cè)定 蛋白質(zhì)的含量，氨基酸氮含量，還需要對(duì)各種氨 基酸進(jìn)行分離，鑒定，尤其對(duì)8種人體必需氨基 酸進(jìn)行定量定性分析。,49,嚴(yán)選課件,一氨基酸的一般定量測(cè)定（一）雙指示劑甲醛滴定法,1.原理：氨

33、基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，它們相互作用而生成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH 基。 2特點(diǎn)：此法簡(jiǎn)單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。（適于食品中游離氨基酸的測(cè)定）,50,嚴(yán)選課件,3雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性紅 50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol

34、/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。 4操作： 取相同兩份樣品2030mg分別于250ml三角瓶各加50ml蒸餾水 一份加中性紅3滴用0.1mol/L NaOH滴定終點(diǎn)（由紅變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml搖勻用0.1mol/L NaOH 滴至淡蘭色。分別記錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。,51,嚴(yán)選課件,5.計(jì)算： 氨基酸態(tài)氮= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性紅為指示劑時(shí)，堿液所消耗的體積 V2用百里酚酞乙醇液為指示劑時(shí)標(biāo)液消耗量 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。 （二）茚三酮的比色法 1. 原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫

35、色化合物，可比色定量。（570nm）,52,嚴(yán)選課件,2.試劑： （1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下： 稱磷酸二氫鉀4.5350g。溶解定容至500ml 稱NaH2PO412H2O 11.9380g，溶解定容至500ml 取上述配好的磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液。 （2）2%茚三酮溶液： 稱茚三酮1g溶于35ml熱水加入40mg氯化亞錫（SnCl2H2O）攪拌過濾（作防腐劑）于冷暗處過夜定容50ml,53,嚴(yán)選課件,（3） 氨基酸標(biāo)液 稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml搖勻吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml

36、，即得200g/ml標(biāo)液 3操作方法： （1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取7個(gè)25ml容量瓶，吸取標(biāo)液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7個(gè)25ml容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測(cè)消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,54,嚴(yán)選課件,（ 2）樣品測(cè)定： 取樣品5.0010.0g（液體樣5-10ml）于燒杯中加50ml水和活性碳約5g加熱過濾用3040ml熱水洗滌活性炭吸澄清樣液14ml加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測(cè)定消光值，按下式計(jì)算氨基酸含量。,

37、55,嚴(yán)選課件,氨基酸含量（毫克/100克）=C100/（m1000） C從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量（g） m 測(cè)定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g） 注意事項(xiàng)： 茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過濾，用2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。,56,嚴(yán)選課件,第五節(jié) 氨基酸的分離與測(cè)定 一薄層色譜法薄層層析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 簡(jiǎn)介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，

38、它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。,57,嚴(yán)選課件,（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。,58,嚴(yán)選課件,Rf = a / b,a,b,樣點(diǎn),溶劑前沿,點(diǎn)樣原點(diǎn),59,嚴(yán)選課件,優(yōu)點(diǎn)： 展開時(shí)間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10100倍） 精確到0.01ug。 也可用于大量分離500 mg，作為樣品制備層析。 缺點(diǎn)：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。 分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。,60,嚴(yán)選課件,（三）操作方法： 薄層板制備：p111 樣品液制備 點(diǎn)樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標(biāo)記作