蛋白質和氨基酸的測定（精制資料）

1、第十章 蛋白質和氨基酸的測定第一節(jié) 概述,一. 蛋白質概況 蛋白質是生命的物質基礎，是構成生物體細胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質。人體內的酸堿平衡、水平衡的維持、遺傳信息的傳遞、物質的代謝及轉運都與蛋白質有關。人及動物只能從食品得到蛋白質及其分解物，來構成自身的蛋白質，故蛋白質是人體重要的營養(yǎng)物質，也是是食品的重要組成之一。一個食品的營養(yǎng)高低，主要看蛋白質含量的高低。蛋白質除了保證食品的營養(yǎng)價值外，在決定食品的色、香、味及結構等特征上也起著重要的作用。,1,嚴選課件,（一）蛋白質組成與分類 1. 組成Composition 蛋白質是復雜的

2、含氮有機化合物，它的溶液是典型的膠體分散體系，由兩性氨基酸通過肽鍵結合在一起的大分子化合物，它主要組成元素是C 、H、O、N、S、P。另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。對于不同的蛋白質，它的組成和結構不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的蛋白質的元素組成百分比。 元素組成百分比：元素 C H O N S P 百分比 50 7 23 16 0-3 0-3 一般來說，蛋白質的平均含氮量為16%，所以在用凱氏定氮法定量蛋白質時，將測得的總氮%乘上蛋白質的換算參數(shù)K=6.25即為該物質的蛋白質含量。,2,嚴選課件,2.按蛋白質的營養(yǎng)價值可將蛋白質分為以下三類： 完全蛋白質：這是一種質量優(yōu)良的蛋

3、白質，含有人體必需氨基酸，并且所含種類齊全，數(shù)量充足，比例合適，不但能夠維持人的生命與健康，而且能促進嬰幼兒的生長發(fā)育。如奶類中的酪蛋白、大豆蛋白及小麥中的麥谷蛋白等，都是人體所必須的完全蛋白質。 半完全蛋白質：此類蛋白質中，所含必需氨基酸種類比較齊全，但含量低，相互間的比例又不合適。如果在膳食中以它作為唯一的蛋白質來源，可以維持生命，但不能促進機體的生長發(fā)育。例如大麥、小麥中的麥膠蛋白。,3,嚴選課件,不完全蛋白質：這類蛋白質中所含必需氨基酸的種類不全，如果在膳食中把它作為唯一的蛋白質來源，既不能促進機體的生長發(fā)育，也難以維持生命。例如玉米中的玉米膠蛋白、豌豆中的豆球蛋白，動物結締組織和肉皮

4、中的膠原蛋白等。 3.食品中蛋白質的氨基酸組成 上面我們已講了蛋白質是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種氨基酸已達175種以上，但是構成蛋白質的氨基酸主要是其中的20種，按照-氨基酸側鏈R基團的結構可分為：,4,嚴選課件,脂肪族類：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。 羥基類：絲氨酸、蘇氨酸 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 堿性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸 酰胺類：天冬酰胺、谷氨酰胺 含硫類：半胱氨酸、蛋氨酸 芳香族類：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 亞氨基酸：脯氨酸,5,嚴選課件,在構成構成蛋白質的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人

5、體中不能合成，必須依靠從食品攝入，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極其重要的生理功能。 限制氨基酸：是指食物蛋白質中一種或幾種必需氨基酸缺少或數(shù)量不足，就會使食物蛋白質合成為機體蛋白質的過程受到限制，亦即限制了此種蛋白質的營養(yǎng)價值，這類氨基酸就稱為。,6,嚴選課件,按易缺少數(shù)量多少的順序排列，稱為第一限制氨基酸、第二等等。如大豆第一限制氨基酸為蛋氨酸。大米第一限制氨基酸為lys，第二限制氨基酸為thr. 評價某種蛋白質的營養(yǎng)價值包括兩個方面：一是各種必需氨基酸含量是否豐富，二是必需氨基酸的構成是否符合一定比例。,7,嚴選課件,（二）各種食品中蛋白質的含量及測定意義 1.含量 由于食品種類很多

6、，所以蛋白質含量分布是不均勻的，一般動物組織蛋白質含量高于植物組織，而且動物組織以肌肉內臟含量較多于其他部分，植物是以種子含量高，豆類含蛋白質最高。 如黃豆蛋白質含量在40%。 牛肉中蛋白質含量為 20.0%左右， 豬肉 9.5%， 兔肉 21%， 雞肉 20% ， 牛乳 3.5%， 帶魚 18.0%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黃瓜 1.0%， 蘋果 1.4%,8,嚴選課件,2.測定意義 測定食品中蛋白質的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產品質量、優(yōu)化食品配方、指導經濟核算及生產過程控制均具有及其重要的意義。 蛋白質 是評價食品質量高低的指標，還關系到人體健

7、康。如果膳食中蛋白質長期不足，將出現(xiàn)負氮平衡，也就是說每天體內的排出氮大于抗體攝入氮，這樣造成消化吸收不良導致腹瀉等。但是攝入量過多會引起機體肝、腎病變。,9,嚴選課件,二.蛋白質的測定方法 蛋白質的測定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質的共性，即利用含氮量，肽鍵等測定蛋白質含量，另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定蛋白質含量。 但是食品種類很多，食品中蛋白質含量又不同，特別是其他成分如碳水化合物，脂肪和維生素等干擾成分很多，故蛋白質的測定最常用的方法是凱氏定氮法。它是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法之一，在國內外應用普遍。由于食品中蛋白質含量不同又分為凱氏定氮常

8、量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。,10,嚴選課件,鑒于食品中氨基酸成分的復雜性，在一般的常規(guī)檢驗中多測定樣品中的氨基酸總量，通常采用酸堿滴定法測定。 色譜技術的發(fā)展則為各種氨基酸的分離、鑒定及定量提供了有力的工具，近年世界上已出現(xiàn)多種氨基酸分析儀，這使得快速鑒定和定量氨基酸的理想成為現(xiàn)實。另外利用近紅外反射分析儀，輸入各類氨基的軟件，通過電腦控制進行自動檢測和計算，也可以快速、準確的測出各種氨基酸含量。下面分別介紹常用的蛋白質和氨基酸測定方法。,11,嚴選課件,第二節(jié) 蛋白質的定量測定關于氮-蛋白質換算系數(shù) 對于氮含量換算成蛋白質含量的系數(shù)，歷來采用6.25，這個數(shù)值是以蛋

9、白質平均含氮而導出的數(shù)值，但是食品中含氮的比例，因食品種類不同，差別是很大的，我們在測定蛋白質時，應該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)，一般手冊上列出了一部分換算系數(shù)，用時可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70，如果手冊上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫報告時要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。 對于用各種原料混合制成的食品，采用占總氮量多的原料為換算系數(shù)，對于一些組成成分不明確的食品可采用6.25，我們在作實驗報告時，一定要注明所用的換算系數(shù)。,12,嚴選課件,一、凱氏定氮法 由Kield

10、hl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法,可應用于各類食品中蛋白質含量的測定。這里只介紹前三種。 （一）常量凱氏定氮法 1. 原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后再以標準HCl溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。,13,嚴選課件,整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定 消化 總反應式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用濃硫酸（98

11、%），濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。 濃硫酸又有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸被還原為二氧化硫： 2H2SO4 +CCO2+2SO2+2H2O 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。 在消化反應中，為了加速蛋白質的分解，縮短消化時間，常加入下列物質：,14,嚴選課件,加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點而加快有機物分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度，一般純硫酸沸點 340，加入硫酸鉀（1689 ）之后可以提高至400以上。原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷的被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故

12、沸點升高，其反應式如下： K2SO4 +H2SO4 =2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O+SO3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失： （NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO4,15,嚴選課件,2（NH4）HSO4 NH3+SO3+H2O 也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點指示劑（做蒸餾時堿性指示劑）。硫酸銅的作用機理如下： C+ 2CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+22SO4 2CuSO4 +SO2+2H2O,16,嚴選課件,此反應不斷進

13、行，待有機物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅生成（褐色），溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點的到達，以及下一步蒸餾時作為堿性反應的指示劑。除硫酸銅外還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦等，應用最廣泛的是硫酸銅。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機 物氧化速度。但要防止氨進一步氧化為氮。一般說來，若有足夠的其他還原劑，如碳，則添加氧化劑不致使測定結果偏低。目前使用雙氧水較多，但必須注意須待消化液完全冷卻后再加入。,17,嚴選課件,儀器：凱氏消化裝置。100頁 要防止爆沸。 幻燈片 21,18,嚴選課件,2. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸

14、餾，放出氨氣?；脽羝?22,19,嚴選課件,3. 吸收與滴定 用4%硼酸吸收，用鹽酸標準溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑，國標用亞甲基蘭+甲基紅）。 指示劑 紫紅色 綠色 淡紫紅 （酸） （堿） （酸） 用過量的 H2SO4 或 HCl 標準溶液吸收，再用 NaOH 標準溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。（pH4.86.0 紅 黃 ）,吸收,滴定,20,嚴選課件,操作步驟： 準確稱取固體樣品0.20-2.00g（半固體25g，液體樣品1020ml）于500ml凱氏瓶中加10g無水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4輕輕搖勻后連接消化裝置，在通風櫥中先以

15、小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中繼續(xù)消化至到樣液呈藍綠色透明時再消化30分鐘，停止消化，冷卻加200ml水幻燈片 18,21,嚴選課件,連接蒸餾裝置用硼酸作吸收液在K氏燒瓶中加玻璃珠數(shù)粒和80ml40% NaOH搖動凱氏瓶至瓶內溶液變?yōu)樯钏{色或產生黑色沉淀，再加入100ml蒸餾水，夾緊夾子加熱蒸餾至氨全部蒸出（餾出液約250ml即可），將冷凝管下端提離液面，用蒸餾水沖洗管口，繼續(xù)蒸餾1分鐘，以奈氏試劑檢查餾出液，如無紅棕色物生成，則蒸餾完畢，可停止加熱用0.1M HCl滴定至藍色變?yōu)槲⒓t色即為終點。 2. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉

16、加熱蒸餾，放出氨氣。,22,嚴選課件,奈氏試劑Nessler試劑，K2（HgI4） 檢驗NH4+離子，遇銨根，離子析 出黃色或紅棕色沉淀。 配制 方法1- 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。 方法2- 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。,23,嚴選課件,下面針對幾點來說明影響氨化完全和速度快的因素 （1）K氏燒瓶和取樣量 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800100

17、0ml的更好，這樣的K氏燒瓶對于縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。 （2）分解劑 A H2SO4和K2SO4的添加量 有機物分解需要的H2SO4量應根據(jù)有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。,24,嚴選課件,K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g樣品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 這種比例在國內外都使用，是公認的 還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10g：20ml B 催化劑 用作催化劑的有Hg、HgO、Se、CuSO4、TiO2，對Hg，HgO有毒但

18、效果好，Se與CuSO4效果相似，TiO2的結果偏低，采用不同的催化劑則消化時間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測定結果時要注明催化劑的類型。,25,嚴選課件,（3）熱源的強度 消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大，即便K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏燒瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。,26,嚴選課件,（4）氨的蒸餾和吸收及滴定 蒸餾加NaOH是40%，加的量為H2SO4量的3倍，硫酸量為20ml，則NaOH為203=60ml，而且一般高于這

19、個理論值，即加到7080ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。 吸收液有：1標準H2SO4 用標準堿反滴定，甲基紅指示劑 2 硼酸 用HCl進行滴定，混合指示劑 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險起見一般用4%。,27,嚴選課件,結果計算：101頁 注意：F氮換算為蛋白質的系數(shù)，一般為 6.25 也可查表。 說明： 所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。 消化時不要用強火，應保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內壁上的含氮

20、化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。 消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消化完全。,28,嚴選課件, 樣品中若含脂肪較多時，消化過程中易產大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。 當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。,29,嚴選課件, 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣

21、品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時發(fā)黑。 蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。,30,嚴選課件,二、微量凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 凱氏燒瓶100ml 可用微量滴定管。 3、蒸餾裝置見 102

22、頁圖 5-9 。,31,嚴選課件,10-2,5-9,32,嚴選課件,4.說明： 蒸餾前給水蒸氣發(fā)生器內裝水至2/3處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結果。 蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程不得?；饠嗥駝t將發(fā)生倒吸。 加堿要足量，操作要迅速；漏斗應采用水封措施，以免氨由此逸出損失。 2硼酸吸收液每次用量為25ml，用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2滴。,33,嚴選課件,三、自動凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、特點： （1）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘

23、可消化完畢。 （3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗洠?2分鐘完成1個樣。,34,嚴選課件,35,嚴選課件,半自動凱氏定氮儀,36,嚴選課件,第三節(jié) 蛋白質的快速測定法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，但除自動凱氏定氮法外，均操作費時，且有環(huán)境污染，影響操作人員健康。 為滿足生產單位對工藝過程的快速控制分析，盡量減少環(huán)境污染和操作簡便省時，因此又陸續(xù)創(chuàng)立了不少快速測定法。 包括雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結合法、 水楊酸比色法等。,37,嚴選課件,一.雙縮脲法 1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時

24、，兩分子縮和成雙縮脲。,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡和物，此反應叫雙縮脲反應。（縮二脲反應） 蛋白質分子中含有肽鍵（ CONH），與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反應，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,38,嚴選課件,注：測蛋白質時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化,2.方法特點及應用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器： 分光光度計，離心機（4000 r/

25、m in） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液,39,嚴選課件,甘油作為穩(wěn)定劑：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時慢慢加入50ml4%CuSO4。 酒石酸鈉作穩(wěn)定劑，吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。 (2) 四氯化碳,40,嚴選課件,5操作方法：標準曲線繪制 準確稱0.6g樣品使用試劑 準確稱0.5g樣品使用試劑 假如用試劑 （1）標準曲線繪制 按凱氏定氮法測出蛋白質含量的樣品為

26、標樣，根據(jù)樣品中蛋白質含量，取離心澄清液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中分別加水定容，在560nm波長下測定其吸光度。 以蛋白質含量為橫坐標，以上述吸光度為縱坐標繪制標準曲線。,41,嚴選課件,（2）準確稱樣0.5g于80ml離心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑蓋上蓋子離心10min（4000轉/分）放置1小時吸混合液15ml于20ml離心管中離心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm處測定吸光度，從標準曲線上查出蛋白質含量。,42,嚴選課件,4 計算：蛋白質%=（C/W）100 C-從標準曲線上查得得蛋白質含量（mg） W-

27、測定樣液時相當于樣品重量（mg） 三紫外吸收法 1原理：利用蛋白質的特有基團，,在紫外區(qū)內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質濃度（38mg/ml）成直線關系，因此，通過測定蛋白質溶液的吸光度，并參照事先用凱氏定氮法分析的標準樣品，從標準曲線查出蛋白質的含量。,43,嚴選課件,2適用范圍：常用于生物化學工作，因為干擾因素多，故在食品分析領域應用不廣泛。 3主要儀器： 紫外分光光度計 離心機（3000 5000 r/min） 4操作：（1）標準曲線的繪制：準確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用

28、四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每分鐘30005000轉的速度離心10分鐘，分別吸取上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個10ml容量瓶鐘，每個容量瓶各加入8mol/l脲的氫氧化鈉溶液至標線，充分搖2分鐘（如果混濁再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測定其吸光度。（做參比值）,44,嚴選課件,以事先用凱氏定氮法測定的樣品中蛋白質的含量為橫坐標，上述的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。 （2）樣品測定 準確稱取試樣1.00g于50ml燒杯中加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml攪拌10分鐘四層紗布過濾到離心管中用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測吸

29、光度，從標準曲線上查出蛋白質的含量。 計算： 蛋白質= （C/W）100 C-從標準曲線上查得的蛋白質含量（mg） W-測定樣品溶液相當于樣品量（mg） 說明：a.此法運用于糕點，牛乳和可溶性蛋白質樣品，測定糕點時，應把表皮顏色去掉。b.溫度對蛋白質水解有影響，操作溫度應控制在2030。,45,嚴選課件,四.水揚酸比色法： 1.原理： 樣品中的蛋白質經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有藍色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。 2.方法 （）標準曲線的繪制 取6個25ml容量瓶編號 0 1 2 3 4 5 6

30、分別加空白酸液 2ml 分別加磷酸鹽緩沖液 5ml 稀釋至總體體積至 15ml 分別加水揚酸鈉 5ml 37C水浴 15分鐘 加入次氯酸鈉 2.5ml 37C水浴 15分鐘 取出加水至標線，于660nm下進行比色測定，繪標準曲線,46,嚴選課件,（2）樣品處理： 準確稱樣0.201.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化直到出現(xiàn)暗綠色時搖動瓶子K氏瓶全部消化后冷卻加水至250ml容量瓶。 （3）樣品測定： 準確吸取上述消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容準確吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸緩沖液以下操作與標準曲線繪制的步驟相同 并以試劑空白微對

31、照，測得樣液的光密度，從標準曲線查出其含氮量。 （4）計算 CF 含氮%= - 100 W10001000 C-從標準曲線中查出測定樣液的含氮量（g） F-樣品溶液的稀釋倍數(shù) W-樣品重量（g） 蛋白質%=總氮%K（K可為6.25，也可查）,47,嚴選課件,第四節(jié) 氨基酸總量測定 蛋白質經水解或酶解可由大分子變成小的蛋白質成分， 如水解后的產物經胨、肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構成 蛋白質最基本的物質。 水解后的蛋白質和水解前的蛋白質在物理特性，化學結 構以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的 程度有密切關系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程 度，也就可以評價食品的營養(yǎng)價值。 氨

32、基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測 定出17種氨基酸（儀器價格昂貴，不能普遍使用），對于食 品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中，,48,嚴選課件,所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸 百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基 酸態(tài)氮）的百分率表示，當然，如果食品中只含 有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含 氮量計算出氨基酸的含量。 食品在評價蛋白質的營養(yǎng)價值時，除了測定 蛋白質的含量，氨基酸氮含量，還需要對各種氨 基酸進行分離，鑒定，尤其對8種人體必需氨基 酸進行定量定性分析。,49,嚴選課件,一氨基酸的一般定量測定（一）雙指示劑甲醛滴定法,1.原理：氨

33、基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，它們相互作用而生成中性內鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結合，堿性消失，再用強堿來滴定 COOH 基。 2特點：此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產的指標之一。（適于食品中游離氨基酸的測定）,50,嚴選課件,3雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性紅 50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol

34、/L 氫氧化鈉標準溶液。 4操作： 取相同兩份樣品2030mg分別于250ml三角瓶各加50ml蒸餾水 一份加中性紅3滴用0.1mol/L NaOH滴定終點（由紅變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml搖勻用0.1mol/L NaOH 滴至淡蘭色。分別記錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。,51,嚴選課件,5.計算： 氨基酸態(tài)氮= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性紅為指示劑時，堿液所消耗的體積 V2用百里酚酞乙醇液為指示劑時標液消耗量 0.014氮的毫摩爾質量，g/mmol。 （二）茚三酮的比色法 1. 原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應，生成藍紫

35、色化合物，可比色定量。（570nm）,52,嚴選課件,2.試劑： （1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下： 稱磷酸二氫鉀4.5350g。溶解定容至500ml 稱NaH2PO412H2O 11.9380g，溶解定容至500ml 取上述配好的磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液。 （2）2%茚三酮溶液： 稱茚三酮1g溶于35ml熱水加入40mg氯化亞錫（SnCl2H2O）攪拌過濾（作防腐劑）于冷暗處過夜定容50ml,53,嚴選課件,（3） 氨基酸標液 稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml搖勻吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml

36、，即得200g/ml標液 3操作方法： （1）繪制標準曲線： 取7個25ml容量瓶，吸取標液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7個25ml容量瓶，加水補充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標準曲線。,54,嚴選課件,（ 2）樣品測定： 取樣品5.0010.0g（液體樣5-10ml）于燒杯中加50ml水和活性碳約5g加熱過濾用3040ml熱水洗滌活性炭吸澄清樣液14ml加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。,

37、55,嚴選課件,氨基酸含量（毫克/100克）=C100/（m1000） C從標準曲線上查得得氨基酸的量（g） m 測定得樣品溶液相當于樣品的量（g） 注意事項： 茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進行純化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結晶，過濾，用2ml冷水洗滌結晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。,56,嚴選課件,第五節(jié) 氨基酸的分離與測定 一薄層色譜法薄層層析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 簡介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，

38、它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達到分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進行，所以稱為薄層層析。它的應用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農藥殘留量、黃曲霉毒素等。,57,嚴選課件,（一）原理： 取一定量經水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。,58,嚴選課件,Rf = a / b,a,b,樣點,溶劑前沿,點樣原點,59,嚴選課件,優(yōu)點： 展開時間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10100倍） 精確到0.01ug。 也可用于大量分離500 mg，作為樣品制備層析。 缺點：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。 分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。,60,嚴選課件,（三）操作方法： 薄層板制備：p111 樣品液制備 點樣：距薄板底端2cm處，用針畫一標記作