《發(fā)酵工藝控制》PPT課件.ppt

1、王彥杰 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 HLJ August First Land Reclamation University,發(fā)酵工程及設(shè)備Fermentation Engineering and Equipment,分批培養(yǎng)中微生物的生長(zhǎng),遲滯期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,穩(wěn) 定 期,死亡期,第三節(jié)發(fā)酵控制與中間補(bǔ)料,補(bǔ)料的理由,初始培養(yǎng)基中葡萄糖過(guò)多引起抑制,代謝后碳氮源不平衡、微量元素缺乏,次級(jí)代謝產(chǎn)物的合需補(bǔ)加前體,初始培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)過(guò)于豐富造成菌濃過(guò)大,中后期營(yíng)養(yǎng)不足，菌體過(guò)早衰老,一、中間補(bǔ)料的方法、意義及內(nèi)容,方法：采用較低濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，待菌體長(zhǎng)到一定階段，補(bǔ)入適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，延長(zhǎng)發(fā)

2、酵產(chǎn)物合成期。,意義：控制菌的生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)中期的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)合成期，推遲菌體自溶；加入前體增加合成產(chǎn)物的中間體，從而使產(chǎn)量大幅度提高。,中間補(bǔ)料內(nèi)容,1、碳源,2、氮源,3、前體,4、無(wú)機(jī)鹽和水,控制和引導(dǎo)產(chǎn)生菌在培養(yǎng)過(guò)程中，特別是中期的生化代謝活動(dòng)向著有利于產(chǎn)物合成和分泌的方向發(fā)展。,二、補(bǔ)料控制,補(bǔ)什么？怎么補(bǔ)？如何控制？,1、補(bǔ)充微生物所需的能源和碳源,碳源是微生物菌體生長(zhǎng)時(shí)需要量最大的物質(zhì)，在發(fā)酵前期消耗很快，到了產(chǎn)物合成階段菌體要維持活性必須補(bǔ)充碳源，以便延長(zhǎng)產(chǎn)物合成期。,實(shí)例：谷氨酸,在原發(fā)酵控制工藝的基礎(chǔ)上，減少初糖濃度，增加生物素用量達(dá)5ug/L，加大接種量到10%左右，以

3、利于菌體迅速繁殖，獲得生產(chǎn)需要的足夠量的菌體。,當(dāng)進(jìn)入產(chǎn)酸期，殘?zhí)沁_(dá)2%左右，連續(xù)補(bǔ)糖，維持糖濃度在2%左右，提高溫度到3637，通氨或流加尿素維持pH7.07.5，利用菌體所形成的酶系繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸可達(dá)10%，提高了30%以上。,后來(lái)補(bǔ)糖方法在抗生素發(fā)酵中普遍采用。,補(bǔ)糖控制考慮的因素 補(bǔ)糖時(shí)間、補(bǔ)糖量、補(bǔ)糖方式,參考數(shù)據(jù)： 糖耗速率、殘?zhí)菨舛?、pH變化、菌體濃度、菌絲形態(tài)、發(fā)酵液粘度、溶氧濃度等。,指標(biāo)： 1.根據(jù)還原糖水平，如赤霉素還原糖降到0.6%就要補(bǔ)糖。 2.根據(jù)總糖水平，根據(jù)菌的酶系和pH變化的大小決定。,注意：不同的發(fā)酵階段控制的殘?zhí)菨舛炔煌?補(bǔ)糖時(shí)間 補(bǔ)糖時(shí)間控制很重要，

4、過(guò)早會(huì)剌激菌體生長(zhǎng)，加速糖的消耗，補(bǔ)糖過(guò)遲會(huì)使菌體所需要的能量供應(yīng)跟不上，干擾菌的代謝。,例：四環(huán)素 補(bǔ)糖時(shí)間（h)96h效價(jià)(u/ml） 206000 4510000 626000,說(shuō)明,開(kāi)始補(bǔ)糖的時(shí)間必須根據(jù)代謝的變化情況來(lái)決定，根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源種類(lèi)及用量，菌絲生長(zhǎng)情況，糖的消耗速率及殘留水平來(lái)綜合考慮，不能單純以時(shí)間為依據(jù)。,例：根據(jù)殘?zhí)菨舛妊a(bǔ)料發(fā)酵提高納他霉素產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)條件： 當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度分別降至3%、2.5%、2%、1.5%時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖，維持糖濃度分別在3%、2.5%、2%、1.5%，研究對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響，發(fā)酵周期均為96h,結(jié)果如表2。,采用間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵，補(bǔ)加時(shí)間

5、以發(fā)酵液中還原糖水平為控制指標(biāo)。,補(bǔ)糖量,補(bǔ)糖量的控制以控制菌體濃度不增加或略增加為原則，使產(chǎn)生菌的代謝活動(dòng)有利于產(chǎn)物合成。,不同補(bǔ)糖速率對(duì)發(fā)酵的影響,初糖濃度為80g/L，發(fā)酵30h后 ,分別以10g/Lh、25g/Lh、40g/Lh的補(bǔ)糖速度進(jìn)行補(bǔ)糖，結(jié)果見(jiàn)表3。,補(bǔ)糖方式可分為：連續(xù)流加 少量多次 大量少次,補(bǔ)糖方式,連續(xù)流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起環(huán)境突然改變給菌體代謝帶來(lái)的影響。,例：L纈氨酸補(bǔ)料分批發(fā)酵的研究 分別用不同的補(bǔ)料方式進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵 一次定量加入： 在發(fā)酵30h，殘?zhí)菨舛葹?2%時(shí)，一次性補(bǔ)加467ml補(bǔ)料液（60%葡萄糖溶液），使總糖濃度達(dá)到15%。,間

6、歇定量加入： 在初糖濃度降為12%時(shí)補(bǔ)加117ml的補(bǔ)料液，每當(dāng)殘?zhí)菨舛冉禐?2%時(shí)補(bǔ)加，共分4次補(bǔ)完。,間歇恒速流加： 每當(dāng)殘?zhí)菨舛冉禐?2%時(shí)就以25g/Lh的速度流加料液，直至467ml補(bǔ)料液全部補(bǔ)完。,在三種補(bǔ)料方式中，采用恒速流加方式發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)亲畹?，間歇定量相對(duì)較低，殘?zhí)橇枯^高的是一次定量流加方式，從纈氨酸的產(chǎn)量，糖酸轉(zhuǎn)化率及菌體濃度比較也是恒速流加的補(bǔ)料方式效果好。,不同的流加方式會(huì)有不同的結(jié)果 例:不同的補(bǔ)料方式對(duì)酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響,恒速流加補(bǔ)料分批培養(yǎng),指數(shù)流加補(bǔ)料分批培養(yǎng),恒一pH補(bǔ)料分批培養(yǎng),流加補(bǔ)料模式,培養(yǎng)條件,裝量3L,接種量5%. 空氣流量為1L/L min

7、 用適量的酸、堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH至.5 溫度30，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)12 h，然后流加40g/L的葡萄糖，72h培養(yǎng)結(jié)束。,好處：解除了底物抑制葡萄糖阻遏效應(yīng)，結(jié)果延長(zhǎng)了菌體的生長(zhǎng)周期，增加了菌體濃度和GSH產(chǎn)量，圖2表示了恒速流加的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,恒速流加培養(yǎng) 在培養(yǎng)過(guò)程中以恒定的流速加入葡萄糖。,指數(shù)流加分批培養(yǎng),F1=u*V0X0exp(u*t)/Yx/y (SF-S),理由：恒速流加過(guò)程由于葡萄糖流加的速度始終恒定，在發(fā)酵前期菌體濃度低，葡萄糖難以完全消耗，而在發(fā)酵的后期，菌體濃度很高，葡萄糖又不能滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)的需要，因此采用指數(shù)流加的方式利于菌體的生長(zhǎng)，圖3表示了指數(shù)流加的實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果。,圖3表明：在培養(yǎng)72h之后，發(fā)酵液中可以達(dá)到極高的菌體濃度，然而經(jīng)與圖2比較后發(fā)現(xiàn)，盡管菌體濃度提高，獲得的酵母菌體中的GSH含量有所降低，發(fā)酵液中的GSH總量增加不大。這可能是后期較高的葡萄糖流加速度抑制了GSH的合成。,恒一pH補(bǔ)料的培養(yǎng)模式,根據(jù)培養(yǎng)基pH變化，流加40g/L的葡萄糖，當(dāng)pH降低時(shí)，加入堿液調(diào)節(jié)pH，達(dá)到設(shè)定的數(shù)值。根據(jù)糖的消耗加入適量的葡萄糖，由于葡萄糖的分解使pH下降，當(dāng)pH下降至一定程度之后，則又加入適量的堿液使pH升高，如此反復(fù)至60h流加結(jié)束，72h培養(yǎng)結(jié)束。,圖4表示了恒pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，采用恒一pH補(bǔ)料分批培養(yǎng)既可以獲得較高的菌體濃

9、度，菌體中的GSH含量又較高，達(dá)到了菌體合成和GSH生產(chǎn)的相對(duì)統(tǒng)一，因此，發(fā)酵液中的總GSH含量最高。,End Thanks!,2.補(bǔ)充微生物所需的各種氮源,補(bǔ)充有機(jī)氮源,補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源：通氨、補(bǔ)硫酸氨,生產(chǎn)上補(bǔ)氮有兩種,補(bǔ)氮是發(fā)酵控制的另一個(gè)重要項(xiàng)目，主要作用是調(diào)節(jié)pH和補(bǔ)充菌體所需的氮源，從而控制代謝活動(dòng)。,（1）補(bǔ)有機(jī)氮,添加某些具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)代謝作用的有機(jī)氮源如尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米漿，保持菌的活性，補(bǔ)充產(chǎn)物合成所需的氮源。 有時(shí)與碳源一起配合補(bǔ)料，工廠(chǎng)稱(chēng)作補(bǔ)混合料。,例：土霉素發(fā)酵前期補(bǔ)23次酵母粉，放罐單位比對(duì)照高1500u/ml。青霉素發(fā)酵47h開(kāi)始加尿素，每6h補(bǔ)加一次，結(jié)合補(bǔ)

10、加乳糖，發(fā)酵單位可達(dá)40000u/ml以上。 補(bǔ)料依據(jù)：氨基氮的消耗、菌的濃度、pH,在谷氨酸生產(chǎn)中，前 12h為菌體生長(zhǎng)階段，由于菌體生長(zhǎng)快，氮被利用，使pH下降，這時(shí)要及時(shí)流加尿素，供給菌體生長(zhǎng)所需的氮源并調(diào)節(jié)pH,生產(chǎn)階段菌體生長(zhǎng)停止，尿素補(bǔ)尿酶分解為氨，pH上升，氨被利用合成谷氨酸，使pH下降，再次添加尿素。,pH,t,補(bǔ)無(wú)機(jī)氮源,通氨 通氨是某些抗生素提高產(chǎn)量的有效措施，它的作用是補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源和調(diào)節(jié)pH。通氨一般使用壓縮氨氣或氨水（20%），采用少量間歇添加或自動(dòng)添加，由空氣管道流入與發(fā)酵液均勻混合。氨濃度控制通過(guò)測(cè)定氨的比消耗速率，菌的比生長(zhǎng)速率，產(chǎn)物比合成速率、pH值來(lái)控制補(bǔ)加速

11、率。,補(bǔ)硫酸銨,例：林可霉素原來(lái)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（NH4）2SO4為0.6%，18h后減少到7mg/100ml,發(fā)酵后期缺少氮源 改進(jìn)工藝：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（NH4）2SO4 減少為0.5，14.6h開(kāi)始補(bǔ)加30% （NH4）2SO4溶液，根據(jù)培養(yǎng)液的pH和H2-N濃度控制補(bǔ)加量正常情況下H2-N保持在10mg/100ml以下，平均補(bǔ)加（NH4）2SO41.5%,提高了發(fā)酵單位。,補(bǔ)氮控制：補(bǔ)氮時(shí)間、補(bǔ)氮量、補(bǔ)氮方式,根據(jù)氮的消耗速率、菌濃度、發(fā)酵液粘度、pH來(lái)決定補(bǔ)料的時(shí)間和補(bǔ)料的量。 補(bǔ)充黃豆餅粉、酵母粉一般采取分批補(bǔ)料，而無(wú)機(jī)氮源和尿素一般采取流加的方式，因?yàn)檫@些氮源對(duì)pH 影響大，而且過(guò)多的

12、氨離子會(huì)對(duì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。,補(bǔ)料濃度的確定可以以搖瓶的基質(zhì)殘留濃度為依據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)。,當(dāng)同時(shí)需要補(bǔ)充碳源和氮源時(shí)可以混合起來(lái)一起加入。,補(bǔ)入碳源還是氮源以及它們的量要根據(jù)產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成來(lái)決定。有的發(fā)酵氮源很低也不需補(bǔ)氮源，是因?yàn)楫a(chǎn)物分子中幾乎不含氮。,3.補(bǔ)前體和無(wú)機(jī)鹽,在發(fā)酵過(guò)程中添加前體可以顯著增加產(chǎn)量及控制發(fā)酵方向。 青霉素G合成的前體 內(nèi)酰胺環(huán)：氨基已二酸、纈氨酸、半胱氨酸 側(cè)鏈：苯乙酸,前體確認(rèn)實(shí)驗(yàn),用同位素標(biāo)記原子來(lái)證實(shí) 苯環(huán)中含H2的苯乙酸 D1-N 15纈氨酸 加入到發(fā)酵液中，測(cè)定所形成的青霉素分子內(nèi)的H2 ，發(fā)現(xiàn)有92.5%的青霉素由該前體形成，而青霉素中的N

13、15只占2.69%。 證明苯乙酸部分進(jìn)入青霉素,苯乙酸對(duì)青霉素產(chǎn)量和類(lèi)型的影響,苯乙酸添加速度%,苯乙酸添加速度%,青霉素類(lèi)型,青霉素產(chǎn)量,苯乙酸添總量%,G,X,F,FH,0,0.025,0.025,0,0.18,0.40,550,1321,1823,13.6,2.1,0.2,31.8,82.8,96.2,22.8,7.3,1.9,17.6,5.1,1.2,添加速率為0.05%，青霉素產(chǎn)量大，而且可使青霉素G含量提高。,苯乙酸具有毒性，青霉素是借苯乙酸與氨基酸結(jié)合形成青霉素而解毒，因此加入前體能形成青霉素，但必須適量而不能過(guò)量。,并非添加速率越大越好，據(jù)研究表明，加入苯乙酸濃度越高，苯乙酸的利用率越低。苯乙酸可被菌氧化，先氧化成鄰羥苯乙酸，然后苯環(huán)被破壞形成酮戊二酸，再經(jīng)TCA循環(huán)氧化為CO2和H2O，苯乙酸作為碳源被消耗掉。,添加時(shí)間的影響,在肌苷生產(chǎn)中發(fā)酵需添加次黃嘌呤作為前體，實(shí)驗(yàn)表明24h、48h補(bǔ)加，分別增加產(chǎn)量199%和130%，可見(jiàn)24h時(shí)補(bǔ)比48h補(bǔ)加增加產(chǎn)量更多。,4.補(bǔ)水和無(wú)機(jī)鹽,當(dāng)發(fā)酵液過(guò)于粘稠時(shí)補(bǔ)水可以稀