pUC質粒DNA的提取、純化及檢測

1、 山東大學實驗報告 2013年 9 月19日至10月3日姓名 系年級 2011級生物技術 組別四 科目分子實驗 學號 同組者 題目 pUC19質粒DNA的提取，純化及檢測 一、【實驗題目】pUC19質粒DNA的提取，純化及檢測2、 【實驗目的】1. 掌握堿變性提取法提取質粒的基本原理和方法，理解各種試劑的作用。2. 掌握質粒純化的基本原理及各種試劑的作用。3. 掌握瓊脂糖凝膠電泳進行質粒檢測分離的原理。4. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的制備和電泳方法。5. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的觀察方法及凝膠成像儀的操作方法。三、【實驗試劑與器材】1. 材料 大腸桿菌DH5（E.coli DH5） 2. 試劑 LB液體

2、培養(yǎng)基，氨芐青霉素（ Amp）母液（20mg/ml），溶液，溶液，溶液，3M NaAc溶液，無水乙醇，70%乙醇，TE溶液，Rnase A,苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），滅菌雙蒸水ddH2O，1TAE，6loading buffer，Supercoiled DNA Ladder Marker，-Hind III digest DNA Marker，溴化乙錠（EB）3. 儀器 培養(yǎng)皿，接種環(huán)，三角瓶（100ml、300ml），酒精燈，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，50ml離心管，1.5ml塑料離心管（eppendorf管），高速離心機，漩渦振蕩器，移液槍，不同型號槍頭（10ul，200ul，1ml），

3、電泳儀，微波爐，滅菌鍋，吸水紙，記號筆，移液管，洗耳球，PE手套，橡膠手套，滴管，天平，稱量紙，冰箱，凝膠成像儀等4、 【實驗原理】1.堿變性法提取質粒及酚、酚/氯仿、氯仿/異戊醇純化質粒質粒由于分子小、能自主復制、攜帶抗性基因、便于分離和提取，經常用在DNA重組中，攜帶目的基因進入細菌、動物細胞或植物體內進行擴增與表達，是基因工程中一種非常重要的載體。構建重組DNA分子需要首先從宿主細胞中提取高質量的質粒DNA。提取和純化質粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經典和常用，適于不同量質粒

4、DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進行。提取的質粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質粒DNA一般包括三個步驟：培養(yǎng)細菌以擴增質粒；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。在細菌細胞中，染色體DNA以雙螺旋結構存在，質粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。細胞破碎后，染色體DNA和質粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達12.0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性；共價閉合環(huán)狀質粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。當用pH值4.6的KAc（或NaAc）高鹽溶液調節(jié)堿性溶液至中性時，變性的

5、質粒DNA可以恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結構而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復性的溶于溶液的質粒DNA分離。溶于上清液的質粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質粒DNA。2. 瓊脂糖凝膠電泳電泳是帶電物質在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定

6、pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質，它具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學的核心技術之一。凝膠電泳技術操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目

7、的的實驗。分子生物學實驗中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構型和方位進行電泳。選擇上述提及的參數(shù)或條件主要取決于被分離的DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，適用于較小分子核酸（5500bp）的分離和蛋白質電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質量上相差0.1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行DNA序列分析的分子基礎。雖然它能很快地進行電泳，并能容納較大的DNA樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上還是繁瑣些。聚丙烯酰胺凝膠電泳是在恒定電場中垂直方位上進行的。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物

8、，由-D-吡喃半乳糖與1,4連接的3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對分子質量為104105。當瓊脂糖加熱至90左右，即可熔化形成清亮、透明的液體，澆在模板上冷卻后固化形成凝膠，其凝固點為4045。瓊脂糖比聚丙烯酰胺凝膠的分辨率略低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段DNA（5020000bp）最適合在恒定強度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質量，分離經限制酶水解的DNA片段，進一步純化DNA等。瓊脂凝膠糖電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基團而帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的

9、電泳遷移速率主要取決于下面6個因素：（1）樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對分子質量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的構象：相對分子質量相同而構象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結構的質粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉變?yōu)榫€狀DNA分子。這三種構型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。（3）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA

10、片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質量越大，選用的凝膠濃度應越低。（4）電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應小于5V/cm。（5）緩沖液：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。當電泳液為去離子水，溶液的導電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，產生大

11、量的熱，有時甚至熔化凝膠 或使DNA變性。電泳時常用的緩沖液有乙酸鹽（TAE）、硼酸鹽（TBE）和磷酸鹽（TPE）幾種不同的電泳緩沖液，通常配成10或5的濃縮母液保存于室溫下，用時稀釋至工作濃度。電泳緩沖液的工作濃度約50mmol/L，工作pH在7.57.8之間。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽極變堿性，陰極變酸性），長時間電泳需要更換緩沖液；TBE、TPE緩沖液緩沖能力較強，可以重復使用數(shù)次。TAE緩沖液可以分離數(shù)kb長度的DNA，在精制DNA片段以及染色體DNA進行雜交時比較常用。相反，TBE緩沖液適于鑒定、分離短小的DNA片段。（6） 溫度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大

12、小DNA片段的相對電泳遷移率在430內無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進行，而當瓊脂糖含量少于0.5%時，凝膠很脆弱，最好在4下電泳以增加凝膠強度。3.常用的DNA分子標準物的電泳圖譜及分子大小五、【實驗步驟】1.準備實驗 配制LB液體培養(yǎng)基，分裝至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，包扎。另配LB固體培養(yǎng)基，包扎；準備10ul、200ul、1ml槍尖各一盒，1.5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個，移液管，包扎、標記，連同LB培養(yǎng)基一同滅菌。2. 菌體培養(yǎng)（1） 點燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒，冷卻，滅菌（2） 向20ml液體LB培養(yǎng)中加入2

13、0ul氨芐青霉素，混合均勻。（3） 在含有氨芐青霉素的LB平板上，用接種環(huán)挑取提前活化的含有有質粒pUC19的E.coli DH5單菌落，接種于（2）的培養(yǎng)基中，之一接種環(huán)的圓環(huán)處在液壁交界面研磨至菌苔分散進入培養(yǎng)液。（4） 用棉塞塞住瓶口，用牛皮紙包住，并用繩子系緊。（5） 37，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，約12h。3.擴大培養(yǎng)吸取菌液0.8ml轉接至含氨芐青霉素的80ml LB液體培養(yǎng)基（Amp 100ug/ml）中，37，200rpm振蕩培養(yǎng)6h。4.質粒提?。?） 稱量一個50ml離心管的重量w1，記錄為14.53g。（2） 將35ml菌液轉入離心管內，標記為2-4-1。菌液應距管口1

14、cm以防離心時菌液外溢，與其它組同學配平后，于6000rpm離心5min，棄上清。（3） 加入5ml溶液打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器混勻，于6000rpm離心5min，棄上清，稱重w2為14.69g,所以菌泥重量為0.16g.（4） 向離心管中加入2.0ml溶液,充分渦旋振蕩，冰浴5min。（5） 向離心管中加入4.0ml溶液，懸滴快速加入，輕柔顛倒混勻，發(fā)現(xiàn)離心管中的溶液變得有一些粘稠，冰浴5min。（6） 向離心管中加入3.0ml溶液，緩慢輕柔上下顛倒混勻，發(fā)現(xiàn)離心管中出現(xiàn)了白色絮狀沉淀物，冰浴5min。（7） 12000rpm離心15min，將上清液輕輕轉入新的離心管2，標記為2-4-2，

15、記錄上清液體積V為9ml.（8） 加入18ml冰乙醇，混勻，-20靜置15-30min。（9） 12000rpm離心15min,棄上清。（10） 加入5ml 70%乙醇，12000rpm離心5min,棄上清。（11） 重復洗滌一次；吸棄上清，37風干5-10min。（12） 分次加入1mlTE溶解沉淀并轉移到Ep管中，得到質粒DNA粗提物，加入50ul RNase A，37靜置1-2h,-20保存待用。5.質粒純化（1） 向上次得到的粗提物平均分裝至兩個Ep管中。（2） 用滴管懸滴加入500ulTris飽和酚溶液，振蕩混勻，配平后于12000rpm離心5min，觀察到溶液分為三層，上層澄清，中

16、間為白色的蛋白，下層淡黃色。（3） 將上清液轉入新管，記錄兩管的體積均為450ul。（4） 用滴管分別向兩管懸滴加入450ul苯酚：氯仿：異戊醇溶液，顛倒混勻，觀察到溶液分為兩層，兩層均是透明無色，配平后于12000rpm離心5min。（5） 將上清液轉入新管，其中1號管體積為400ul，2號管體積為360ul。（6） 用滴管向1號管懸滴加入400ul氯仿/異戊醇，向1號管懸滴加入360ul氯仿/異戊醇，顛倒混勻，配平后于12000rpm離心5min。（7） 將上清液轉入新管，兩管轉移的液體的體積均為350ul。（8） 向上清液中加入35ul3M NaAc，混勻，加入770ul的冰無水乙醇混勻

17、，-20沉淀30min。（9） 配平后于12000rpm離心15min.，棄上清。（10） 加入500ul 70%乙醇潤洗沉淀表面一次，12000rpm離心2min，棄上清。（11） 重復洗滌一次，吸棄上清，37風干5min。（12） 向其中一管加入30ul TE溶解沉淀，然后將溶液轉移至另一管中，最終得到30ul純化的質粒DNA。6.瓊脂糖凝膠電泳檢測純化的質粒（1 ）配制緩沖液：將50TAE稀釋至1TAE緩沖液（2 ）制膠：稱取0.4g瓊脂糖于300ml三角燒瓶中，加40ml 1TAE制成1%瓊脂糖凝膠。微波爐加熱至瓊脂糖完全溶化，待冷卻至60左右，緩慢倒入架有梳子的電泳膠板中，勿產生氣泡

18、，靜置冷卻30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，將膠連同托盤一起放入電泳槽中央，加入緩沖液，液面應高于膠面1-2mm，準備上樣。（3） 上樣：取2.0ul質粒DNA樣品、2.0ulddH2O及1.0ul 6loading buffer混勻，在加樣孔上方1-2mm處垂直點樣，同時點樣5.0ul超螺旋marker，100ngpUC19，5.0ulpUC19/Hind III 、10ulDNA、5ulDNA/Hind III，100-120V 電泳30-40min（實際時間根據(jù)電泳條帶的遷移情況判斷）。（4） 染色及觀察電泳完成后，將膠放入0.5ug/ml的EB染液中染色約10min，水洗

19、，在凝膠成像儀中觀察電泳結果，攝片，剪輯，保存，分析結果。7.菌株的驗證（1） 配制加入氨芐青霉素和不加氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，滅菌，分別倒一個平板，標加入氨芐青霉素的標號為1,沒加氨芐青霉素的標號為2。（2） 用記號筆將平板分別分為兩部分，在酒精燈下分別將1號平板的左半部分接種E.coli DH5，右半部分接種含pUC19的E.coli DH5。（3） 于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天（4） 觀察大腸桿菌的生長情況，菌落的形態(tài)以及培養(yǎng)基的顏色變化，并記錄實驗結果。6、 【實驗結果】1. 實驗數(shù)據(jù) 表1 pUC19質粒提取、純化和檢測實驗數(shù)據(jù)記錄 實驗步驟 項目 量 質粒提取 菌泥（g） 0.16 溶

20、液I（ml） 2 溶液II（ml） 4 溶液III（ml） 3 質粒檢測 提取質粒上樣量（ul） 2 純pUC19上樣量（ul） 5 純pUC19含量（ng） 1002. 實驗現(xiàn)象 表2 pUC19質粒提取、純化和檢測實驗現(xiàn)象記錄和分析 實驗步驟 實驗現(xiàn)象 實驗現(xiàn)象分析 質粒提取向離心管1中加入溶液II溶液變粘稠如蛋清狀溶液II是強堿性溶液，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性；質粒DNA大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離，在溶液中不溶解向離心管1中加入溶液III出現(xiàn)白色絮狀沉淀溶液III是高鹽溶液，調節(jié)堿性溶液至中性，此時變性的質粒DNA可恢復到原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結構而溶解在

21、溶液中，染色體DNA不能復性，與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物儀器形成纏繞、可見的白色絮狀沉淀加入冰無水乙醇，沉淀30min后 溶液出現(xiàn)少量白色沉淀，肉眼可見DNA不溶于無水乙醇中，以沉淀形式存在無水乙醇沉淀離心后管底部一側壁上沉積有白色沉淀質粒在離心力作用下沉積在外側管壁粗提質粒質粒大部分呈透明狀，少部分地方發(fā)黃粗提質粒不純凈，含有蛋白質等雜質 質粒純化向管中加入Tris飽和酚，混勻離心后溶液分為三層，中層可見白色沉淀苯酚使蛋白質變性而沉淀，由于密度關系，出現(xiàn)上層酚、中層蛋白，下層水的現(xiàn)象向管中加入苯酚/氯仿/異戊醇，混勻離心溶液出現(xiàn)兩個分層，沒有明顯顏色差異苯酚使蛋白變性，氯仿

22、溶解苯酚、脂質，密度高于水，在上層，下層為水相向管中加入氯仿/異戊醇，混勻離心溶液出現(xiàn)兩個分層，沒有明顯顏色差異異戊醇幫助分層，氯仿不溶于水，由于密度關系出現(xiàn)分層加入冰無水乙醇，靜置至少30min理應可見沉淀，但是沒有看見沉淀沉淀量較少，肉眼不可見無水乙醇沉淀后，離心管底部一側壁上出現(xiàn)白色沉淀質粒在離心力作用下沉淀下來，得到純化的質粒純化質粒干燥后基本呈無色透明狀，有極少部分仍有淺黃色純質粒為無色，淺黃色說明質粒中仍有蛋白等雜質的污染3. 瓊脂糖凝膠電泳結果 圖一：堿裂解法pUC19質粒提取、純化和檢測實驗瓊脂糖凝膠電泳圖 注釋：電泳圖從左至右為1-18號點樣孔，其中1號孔為5.0ul超螺旋m

23、arker，2號孔為取100ngpUC19，3號孔為5.0ulpUC19/Hind III ,10號孔為6.0ul超螺旋marker，17號孔為10ulDNA、18號孔為5ulDNA/Hind III，我們組純化的質粒在7號孔。電泳結果圖分析：（1） 超螺旋質粒pUC19大小約為2.7kb，應在超螺旋marker 2kb和3kb條帶之間。從圖譜分析，我們組提取質粒大小正確。與標準pUC19質粒電泳條帶對比，我們提取的質粒電泳條帶粗且亮，表明質粒濃度很高，且上樣量較多，使條帶出現(xiàn)“溢出”現(xiàn)象，屬于正常現(xiàn)象。（2） 在超螺旋質粒pUC19上方可以看見兩條帶，應為質粒的其它兩種構型，其中開環(huán)的泳動速

24、度較慢，位于上方，線性構型位于下方。（3） 電泳圖譜上方靠近點樣孔的位置可見系列條帶，根據(jù)-Hind III digest DNA Marker各條帶的分子量大小判斷，應為染色體DNA，說明質粒中存在著少量的染色體DNA。說明質粒受到了染色體DNA的污染。原因可能是加入溶液II過程持續(xù)時間過長或者加入溶液II混勻動作幅度過大，使染色體DNA發(fā)生斷裂。（4） 電泳圖譜的最下方可見微弱的條帶，該條帶應為少量RNA殘留，說明RNA酶未完全降解RNA。（5） 如圖1所示，點樣孔附近有明顯亮光，分析原因可能是質粒中仍有蛋白質、多糖等雜質污染，蛋白質域DNA結合滯留在點樣孔，經EB染色會發(fā)出熒光（6） 2

25、號孔標準pUC19上樣含量100ng，我們加入的質粒DNA為2ul，粗略估計我們提取的質粒濃度約為100-150ng/ul之間。4. 菌株的驗證 圖二：菌株的驗證左邊為含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，右邊為不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，兩個培養(yǎng)基均接種了E.coli DH5，E.coli DH5（pUC19） 表三：菌株的驗證實驗現(xiàn)象項目加氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基沒加氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基E.coli DH5E.coli DH5（pUC19）E.coli DH5E.coli DH5（pUC19）生長與否 否 生長 生長 生長菌落的形態(tài)、大小、數(shù)量鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整

26、齊，表面光滑，數(shù)量較多菌落白色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，菌落數(shù)量稍微偏少菌落微紅，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，菌落數(shù)量較多培養(yǎng)基的顏色 深紅（西瓜紅） 深紅（西瓜紅）橘黃色橘黃色上述實驗現(xiàn)象說明：氨芐青霉素是有效的。 E.coli DH5（pUC19）有氨芐青霉素抗性。7、 【注意事項】1.在接菌時，將挑有菌體的接種環(huán)在三角瓶壁上靠近液面的地方輕輕碰觸，然后輕輕搖動三角瓶，使液體LB培養(yǎng)基與菌體接觸，當瓶壁接菌處有輕微渾濁現(xiàn)象時，說明接菌成功。輕輕震蕩三角瓶，使全部菌體進入培養(yǎng)基中。2.在離心管內本身已經有沉淀出現(xiàn)時，要在瓶壁上進行標記，以便在將離心管放入離心機時使沉淀朝外。另外使

27、用離心機時要注意配平，取出離心管時注意小心輕拿，保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進入上清液中。3.離心后，要去除上清液時，可以將離心管倒置在紙巾上除去殘留的液體，但要注意觀察沉淀是否穩(wěn)定，防止不小心把沉淀也去掉了。4.加入溶液I時可以劇烈震蕩，因為此時細菌還沒有與溶菌酶完全作用，染色體DNA 還沒有釋放出來，不用擔心其斷裂。當加入溶液II、III后，必須注意不能過度用力震蕩，但是又必須保證溶液混合充分，可以上下顛倒離心管數(shù)次直至混勻。5.進行沉淀干燥時要注意離心管管壁上有沒有液珠，沉淀邊緣2mm要干燥至透明才可以，不然會引入雜質。6.用1mlTE溶解沉淀時要注意吹氣助溶，不要產生氣泡。7.苯酚試劑

28、具有腐蝕性，使用時應該小心，皮膚如果不小心沾到酚，應該立即用堿性溶液、肥皂或大量清水沖洗。8.點樣時要小心操作，可以用兩只手點樣，避免損壞凝膠，也不要快速擠出吸頭內的 樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣孔。9.使用溴化乙錠染色時一定要做好防護措施，應該多戴幾層手套。8、 【實驗分析與討論】1. 何為質粒？其大??？其拷貝數(shù)？質粒是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子（即細胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質粒雖然都是環(huán)狀構形，然而目前也發(fā)現(xiàn)有少數(shù)的質粒屬于線性構形，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中。天然質粒的DNA長度從數(shù)千堿基對

29、至數(shù)十萬堿基對都有。質?？截悢?shù)分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型質粒每個細胞中拷貝數(shù)有限，大約1 幾個；松馳型質?？截悢?shù)較多，可達幾百2.pUC19的大小和質粒圖譜？ 圖三：pUC19圖譜3. 質粒在細胞內的構型有哪些？ 有超螺旋質粒，環(huán)狀，線型三種。4. E.coli DH5的菌株特性？E.coli DH5是大腸桿菌endA基因發(fā)生突變的菌株,在使用pUC系列質粒載體轉化時，可與載體編碼的半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)互補,可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。菌株中很多重組酶、修飾酶等缺失，防止質粒的重組、修飾，能夠保持攜帶質粒的穩(wěn)定性。一般常用于質粒的構建、擴增，較少用于蛋白表達。5.如何將質粒DNA與染色體DN

30、A分離？檢測中如何判斷？堿性條件下，染色體DNA雙螺旋結構解開而變性，質粒DNA的氫鍵斷裂但兩條互補鏈彼此纏繞?；謴椭行詴r，染色體DNA難以復性，質粒DNA分子很快復性，離心時染色體DNA與細胞碎片一起被沉淀出來，而質粒DNA則留在上清液中，由于染色體DNA片段的大小比質粒DNA大，電泳時染色體DNA的遷移速率比質粒DNA的小，距點樣孔的距離短，由此可以將質粒DNA與染色體DNA分離。6.如何將質粒DNA與細胞RNA組分分離？檢測中如何判斷？純化質粒時加入RNA酶將RNA消化，從而將質粒DNA與細胞RNA分離，純化的質粒中殘留的RNA也是經RNA酶消化的小片段的RNA，電泳時遷移速率較快，距點

31、樣孔的距離比質粒DNA遠。7. 如何將質粒DNA與細胞蛋白質組分分離？檢測中如何判斷？ Tris飽和酚使蛋白質變性而去除蛋白質，電泳時蛋白質不移動，依然滯留在點樣孔，點樣孔附近有明顯亮光，分析原因可能是質粒中仍有蛋白質、多糖等雜質污染，蛋白質域DNA結合滯留在點樣孔，經EB染色會發(fā)出熒光。8.瓊脂糖凝膠電泳的緩沖液選擇原則？ 緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。當電泳液為去離子水，溶液的導電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，產生大量的熱，有時甚至熔化凝膠 或使DNA變性。根據(jù)所鑒定的分子的大小選擇緩沖液。電泳時常用的緩沖液有乙酸鹽（T

32、AE）、硼酸鹽（TBE）和磷酸鹽（TPE）幾種不同的電泳緩沖液，通常配成10或5的濃縮母液保存于室溫下，用時稀釋至工作濃度。電泳緩沖液的工作濃度約50mmol/L，工作pH在7.57.8之間。TAE緩沖液緩沖能力弱，長時間電泳緩沖能力逐漸喪失（陽極變堿性，陰極變酸性），長時間電泳需要更換緩沖液；TBE、TPE緩沖液緩沖能力較強，可以重復使用數(shù)次。TAE緩沖液可以分離數(shù)kb長度的DNA，在精制DNA片段以及染色體DNA進行雜交時比較常用。相反，TBE緩沖液適于鑒定、分離短小的DNA片段。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規(guī)則的DNA

33、帶遷移的現(xiàn)象.9. 瓊脂糖凝膠電泳的濃度選擇原則？瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質量越大，選用的凝膠濃度應越低。11.同一質粒的不同構型，在電泳中的遷移速率的差異？在凝膠上的表現(xiàn)行為如何？相對分子質量相同而構象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結構的質粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉變?yōu)榫€狀DNA分子。這三種構型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其

34、次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。在凝膠上表現(xiàn)為距點樣孔的距離為超螺旋型線狀分子開環(huán)狀分子.12.同一構型的不同大小的質?；蛘咂卧陔娪緯r的遷移率差異？在凝膠上的表現(xiàn)行為如何？同一構型的不同大小的質?；蛘咂畏肿釉酱?，摩擦阻力越大，遷移越慢在凝膠上表現(xiàn)為分子越大的距點樣孔的距離越小。13.溶液I的作用溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力作用而降解。EDTA：整合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。14.溶液II的作用溶液II：0.2mol/L NaOH，1%SDS（臨用前用10mol/L NaOH和20%SDS母液配制）。NaOH：DNA在pH大于5、小于9的溶液中是穩(wěn)定的。但當pH12或pH3時，就會引起雙鏈之間的氫鍵解離而變性。溶液II中的NaOH濃度為200mmol/L，加到提取液中時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA