細(xì)胞工程—動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)節(jié)復(fù)習(xí)題

1、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng) - 技術(shù)細(xì)節(jié)1、原代培養(yǎng)： 從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。借助這種方法可以觀 察細(xì)胞的 分裂繁殖 、細(xì)胞的 接觸抑制 、以及細(xì)胞的 衰老，死亡等生命現(xiàn)象。2、傳代培養(yǎng)： 將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或 兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。3、無(wú)菌操作基本技術(shù) : 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái) （laminar flow） 以紫外 燈照射 30-60 分鐘滅 菌，以 70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面， 并開啟無(wú)菌操作臺(tái) 風(fēng)扇 運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘后， 才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理 一株細(xì)胞株 ，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基， 以

2、避免 失誤混 淆 或細(xì)胞間污染 。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以 70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操 作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞， 必要物品， 例如試管架、 吸管吸取器或吸 管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以 70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面中央 無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品， 避免造成污染。 勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口， 亦 不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。 容器打開后， 以手夾住瓶蓋并握住瓶

3、身， 傾 斜約 45 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。工作人員應(yīng)注意自身之安全， 須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 對(duì)于來(lái)自人類 或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái) （ 至少 Class II） 。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起 aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品， 例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：C02鋼瓶的C02壓力C02培養(yǎng)箱的C02濃度、溫度、及水盤是否有污染 （水盤的水用無(wú)菌水， 每周更換 ） 。 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之 airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小 時(shí)

4、/HEPA）。4、培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基貯存于4C冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在 37 C水槽中溫?zé)帷?液體培養(yǎng)基 （加血清） 存放期為六個(gè)月， 期間谷氨酰胺可能會(huì)分解， 若細(xì)胞生長(zhǎng) 不佳，可以再添加適量谷氨酰胺。粉末培養(yǎng)基配制 （注意）： 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加 10 % 血清、 pH 為 - 。粉末 培養(yǎng)基及NaHCO：粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH,而非用 強(qiáng)酸（HCl）或強(qiáng)堿（NaOH）,因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基 的 pH 易發(fā)生改變。純水配制。以 或 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。標(biāo)示培養(yǎng)基種 類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4C。須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。5、抗生

5、素. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素培養(yǎng)自ATCC引進(jìn)之細(xì)胞株，培 養(yǎng)基 中不加抗生素。 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，須添加抗生素，待 token freeze 通過(guò)污染 測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)培養(yǎng)瓶時(shí)，則須添加抗生素（青霉素 100units/ml + 鏈霉素 100 ug/ml） 。. 若要檢測(cè)支原體， 則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加慶大霉素， 因慶大霉素會(huì)抑制支原體生 長(zhǎng)。6血清：-20C或-70C至4C冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml無(wú)菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造 成氣泡），使溫度與成分均一，減

6、少沈淀的發(fā)生。勿直接由- 20E直接至37C解 凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。7. 血清之沈淀物. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種， 但普遍之原因是血清中之脂蛋白 （lipoprotein） 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白 （fibrin） 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影 響血清本身之品質(zhì)。顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”： 通常經(jīng)過(guò)熱處理的血清， 沉淀物的形成會(huì)顯著的增 多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”， 一般而言， 此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影 響細(xì)胞的生長(zhǎng)。8、細(xì)胞冷凍保存注意事項(xiàng)：.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)，約為80 - 90 %致密度。. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否

7、仍保有其特有性質(zhì)，例如 hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一 至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMS3為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色以510 ml小體 積分裝，4C避光保存，勿作多次解凍。甘油亦應(yīng)為 試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅 菌后避光保存 。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。9、冷凍細(xì)胞活化： 1.快速解凍（輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化），以避 免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù) 日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常 （ 例如產(chǎn)生單株抗體 或是其它蛋白質(zhì)）。解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSC或

8、glycerol）， 依細(xì)胞種類而異， 一般而言， 大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。 在解凍培養(yǎng)后隔 日更換培養(yǎng)基大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4=細(xì)胞數(shù)/ml1 冷凍管應(yīng)如何解凍取出冷凍管后， 須立即放入 37 C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在 1 分 鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。 另冷 凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除 DMSC除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中

9、， 待隔天再置 換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼 附之問(wèn)題。3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先 提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì) 于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的 量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。5 何謂 FBS, FCS, CS, HSFBS (fetal bovin

10、e serum)和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calf serum)則 是指小牛血清。 HS (horseserum) 則是指馬血清。6培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 %或10% CO2或根本沒(méi)有影響 一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHC03勺含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHC03含量 為每公升g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % C02當(dāng)培養(yǎng)基中NaHC03為每公升g 時(shí)，則應(yīng)使用 5 % C02 培養(yǎng)細(xì)胞。7 何時(shí)須更換培養(yǎng)

11、基視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基 即可。8 培養(yǎng)基 中是否須添加抗生素 除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之 trypsin-EDTA 濃度應(yīng)如何處理一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為% 。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管 中，保存于-20 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少 污染之機(jī)會(huì)。10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液 太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)

12、取出一部份 含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù) 前述步驟即可。11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過(guò) 高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。12 細(xì)胞之接種密度為何 依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。 細(xì)胞數(shù)太少或稀 釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何 動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10 %DMS0 (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮

13、培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由 于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使 用前先行配制完成。14 DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何冷凍保存使用之 DMSO等級(jí)， 必須為Tissue culture grade 之DMSO如Sigma D2650)，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于4 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO則須使用耐DMSO之 Nylon材質(zhì)濾膜。15 冷凍保存細(xì)胞之方法冷凍保存方法一：冷凍管置于4 C 3060分鐘(-20 C30分鐘*)-80 C 1618小時(shí)

14、(或隔夜)液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二 ： 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1-3 C 至-80 C以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*- 20 C不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大， 造成細(xì)胞大量死亡， 亦可跳過(guò)此步驟直接放入 -80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。適用于 懸浮型細(xì)胞 之保存。16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為每瓶 1x106 cells/ml ， 融合瘤細(xì)胞則以每瓶 5x106 cells/ml 為宜。17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染細(xì)胞污染的種類可分成 細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉

15、漿菌 。主要的污染原因?yàn)?無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、 操作室環(huán)境不佳、 污染之血清和污染之細(xì)胞等。 嚴(yán)格之無(wú)菌 操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好 方法。18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理 加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。19 支原體 （mycoplasma） 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀 不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外， 大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無(wú)法以其外觀分 辨之。20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)

16、據(jù)方有意義。21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔定期（ 至少每?jī)芍芤淮?） 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。23為何培養(yǎng)基保存于4 C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性培養(yǎng)基保存于4 C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之C02會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越 偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑 （ 通常為 phenol red） 的顏色也會(huì) 隨堿性增加 而更偏暗紅 。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿 時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之 C02， 以調(diào)整 pH 值。24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish ，

17、flask 是否均相同不同廠牌的 dish 或 flask ， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。25 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形 研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上 的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。 建議細(xì)胞解凍后不要立刻離 心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。26 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因 研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培

18、養(yǎng)基使用錯(cuò)誤 或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。 血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。 解凍過(guò)程錯(cuò)誤。 冷凍細(xì)胞 解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于-80 C太久。27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因 冷凍管瓶蓋裂紋， 或瓶身破裂， 可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)， 造成 冷凍管裂損， 建議使用止血鉗小心夾取。 另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫， 乃因熱脹冷 縮之物理現(xiàn)象， 冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染， 故冷凍管于放入和取出液氮 桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可

19、能在 DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，首選 MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸 浮細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)最好首選 AIM V（ 12005）培養(yǎng)基（SFM。29 L- 谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎它在溶液中不穩(wěn)定嗎L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的 能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后 會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致 氨的形成， 而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。30 GlutaMAX-I 是什么培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I 這個(gè)二肽有多穩(wěn)定GlutaMAX-l二肽是

20、一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用L-丙 氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-l二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20分鐘， GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解， 如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿 性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用， （特別是雌激素）。為 避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于 酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)

21、基32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳 源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA勺目的是什么二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTAffl來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便 保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA青洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培 養(yǎng)基 中所有的二價(jià)離子。33目錄上說(shuō)，Hanks平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要 CO2培養(yǎng)箱。 原因是什么Hank s平衡鹽溶液（HBS）和Earle s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì) 的功能差別H

22、BS和EBS的主要差別在于 碳酸氫鈉的水平，在Eagles L）中比在Hanks L）中 高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水 平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織， 需要用 Eagles 液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ) 存的組織，用Hanks液就可以了。35 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度 的 50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被 滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，

23、您應(yīng)該在 兩到三周內(nèi)使用 它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。37 大部分添加物和試劑 最多可以凍融 3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶 液引起一定水平的 降解和沉淀 ，將會(huì)影響它的性能。38在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4C冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4C就可能開始降解，如果在室溫下放置超過(guò) 30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。1. 保存血清最好的方法建議血清應(yīng)保存在-5C至-2OC。然而，若存放于4C時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若 您一次無(wú)法用完一瓶，建議您無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。2. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于 28 C冰

24、箱使之融解，然后在室溫下使 之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理 血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因， 但最普遍的原因是由于血清中 脂蛋白 的變性 所造成，而血纖維蛋白 （ 形成凝血的蛋白之一 ） 在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中， 亦是造成沉淀物的主要原因之一。 但這些絮狀沉淀物， 并不影響血清本身的質(zhì)量。 若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心, 上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起 過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮 狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過(guò)濾膜。4. 為什么要熱滅活血清加熱可以 滅活補(bǔ)

25、體系統(tǒng) 。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件， 刺激平滑肌收縮， 細(xì)胞 和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。5. 有必要做熱滅活嗎實(shí)驗(yàn)顯示， 經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清， 對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。 經(jīng)此 處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)， 或完全沒(méi)有任何作用， 甚至通常因 為高溫處理影響了血清的質(zhì)量， 而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。 而經(jīng)過(guò)熱處理的血 清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多， 這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察， 像是“小黑 點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37 C環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使

26、研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。6. 為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀GIBIC0的胎牛血清 沒(méi)有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2-8C時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白 （如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。 這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在-20 C儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。7. 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的 逐步解凍法（-20C至4C至室溫），若血清解凍時(shí) 改變的溫度太大（如-20C至37C），實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。解凍血清時(shí)， 請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。請(qǐng)勿將血清置于 37C太久。若在37C放置太久，血清會(huì)變

27、得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的 成分也會(huì)因此受到損害， 而影響血清的質(zhì)量。 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物 的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56C，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì) 造成沉淀物的增多。8 細(xì)胞凍存復(fù)蘇原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：1）細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。2）如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。 大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器損傷和破裂。3）復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細(xì)胞的凍存 冷凍保護(hù)劑：冷凍保護(hù)

28、劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。 一般只有 紅細(xì) 胞 、大多微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 凍存時(shí)可不加冷凍保護(hù)劑； 但對(duì)大 多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，冷凍時(shí)必須加冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑：甘油、DMSO乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前， 滲透到細(xì)胞內(nèi)， 在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一 定的摩爾濃度， 降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度， 從而保護(hù)細(xì)胞免受高 濃度電解質(zhì)的損傷。非滲透性冷凍保護(hù)劑：主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等大分子物質(zhì)。 其保護(hù)機(jī)制的假說(shuō)很多， 其中有一種是，減少冰晶的形成。冷凍保存溫度 :

29、液氮溫度（-196C）是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196 C時(shí)，細(xì)胞的生命活 動(dòng)幾乎完全停止， 但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。 如果冷凍過(guò)程得當(dāng)， 一般生 物樣品在-196 C下均可保存十年以上。-70-80 C保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞 的活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-40 C 范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。note:甘油和DMS（并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的 時(shí)間進(jìn)行 預(yù)冷，讓其滲透到細(xì)胞內(nèi) ，細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。DMS（在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大， 而在4C時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍 能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)

30、。所以，凍存時(shí) DMS（平衡多在4C下進(jìn)行，一般 需要 40 60 分鐘 。9. 細(xì)胞株運(yùn)輸：1 ） 貼身運(yùn)輸：短途運(yùn)輸，挑選的 生長(zhǎng)狀態(tài)良好 的細(xì)胞裝滿培養(yǎng)基，將瓶口用酒 精棉球擦拭2遍，將瓶蓋擰緊，酒精消毒后用封口膜 封閉，整個(gè)瓶子外表面噴上 酒精，用 塑料手套包裹后 ，豎力貼身放置（或者比較溫暖的地方、 ，運(yùn)輸途中 盡 量避免劇烈震蕩 （避免培養(yǎng)基與瓶口接觸、 細(xì)胞取回后，半量換液（保留吸出 的大部分的培養(yǎng)基，以備以后半量換液用、 2 ） 冰瓶運(yùn)輸：短途運(yùn)輸，從液氮中取出細(xì)胞，放入冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至新的實(shí)驗(yàn)室。3 ） 液氮罐運(yùn)輸：短途及長(zhǎng)途運(yùn)輸，從液氮中取出細(xì)胞，放入裝滿液氮的小型液 氮罐中轉(zhuǎn)運(yùn)至新的實(shí)驗(yàn)室10. 收到 T25 培養(yǎng)瓶包裝細(xì)胞， 處理方式為：1. 寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡， T25 培養(yǎng)瓶均加滿培養(yǎng)基。收 到后應(yīng)檢查培養(yǎng)瓶 外觀，并于顯微鏡下觀察 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象 ，若有 任何問(wèn)題，不要打開蓋子