仔豬大腸桿菌基因工程疫苗

1、仔豬大腸桿菌病基因工程滅活疫苗K88ac-ST1-LTB)新生仔豬大腸桿菌病是由產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌 （Enterotoxigenic E.coli ，ETEC） 引起的一種高度接觸性、急性、致死性腹瀉，特征是排黃色或黃白色稀糞。臨床上以 1 7 日齡新生仔豬下痢為主要特征，其中 13 日齡最多見。個(gè)別耐過仔豬經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間才能 正常生長(zhǎng)，但病愈存活后其生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能指標(biāo)受到嚴(yán)重影響。大腸桿菌性腹瀉在我國(guó)廣泛流行，新生仔豬大腸桿菌性腹瀉的發(fā)病率和死亡率在不 同地區(qū)各有差異，發(fā)病率為 5.69% 86.5%，死亡率為 17.0% 73.0% 。本病是影響?zhàn)B豬 業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。產(chǎn)腸毒素性大

2、腸桿菌（ETEC）有兩類致病因子：一類為黏附素（或稱定居因子，起吸 附固定作用，主要分為 K88 K99 987P、F41等，其中以 心為主。另一類為腸毒素（耐 熱性腸毒素ST和不耐熱性腸毒素LT），是直接導(dǎo)致腹瀉的因子。細(xì)菌通過黏附素固定在 腸黏膜表面，大量繁殖后產(chǎn)生 ST與LT兩種腸毒素，引起劇烈腹瀉，脫水、酸中毒、低 血鉀等。遼寧益康生物股份有限公司科研人員經(jīng)過大量的流行病學(xué)調(diào)查， 病原菌的分離鑒定， 致病因子的研究，從細(xì)菌致病機(jī)理出發(fā)，成功地研發(fā)出免疫譜寬，免疫效果好，使用安 全的仔豬大腸桿菌基因工程疫苗，從根本上解決了新生仔豬大腸桿菌性腹瀉免疫預(yù)防這 一難題，現(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)告如下。一

3、、疫苗免疫機(jī)理妊娠母豬臨產(chǎn)前進(jìn)行大腸桿菌基因工程滅活疫苗免疫接種，產(chǎn)生三種抗體（抗 ST1 抗體、抗 LT 抗體、抗 K88 抗體），仔豬出生后吮食初乳，獲得母源抗體產(chǎn)生被動(dòng)免疫， 從而抵抗大腸桿菌在腸道定居增殖，有效中和腸毒素，獲得保護(hù)力。二、產(chǎn)品特點(diǎn)1、具有良好的免疫原性。針對(duì)致瀉因子耐熱腸毒素（ST）、不耐熱腸毒素（LT）和主要黏附因子心，采用基因 工程技術(shù)構(gòu)建的GE-3菌株，可以有效表達(dá)K88ac-STi-LTB融合蛋白，并輔以氫氧化鋁膠佐 劑，在保留了 K88ac和LTB良好免疫原性基礎(chǔ)上，賦予了 ST1免疫原性。2、構(gòu)建菌株優(yōu)良穩(wěn)定。通過對(duì)菌株的安全性、有效性、菌種限定代次及保存條

4、件、疫苗保存條件及保存期 等試驗(yàn)，證實(shí)了該菌株是一株良好的疫苗候選株。3、該疫苗生產(chǎn)工藝科學(xué)、質(zhì)量穩(wěn)定。通過對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑及其誘導(dǎo)條件、通氣量及菌液滅活等進(jìn)行了 篩選和優(yōu)化，確定了工業(yè)化生產(chǎn)工藝，并通過安全性、效力檢驗(yàn)等試驗(yàn)，批次間穩(wěn)定。4、本疫苗安全性可靠、無毒副作用。采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型接種，田間與區(qū)域本動(dòng)物接種等試驗(yàn)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，表明本 疫苗無腸毒素活性、無致病性，妊娠母豬臨床母豬全部存活，均無流產(chǎn)、死胎和胎兒 畸形等現(xiàn)象，分娩正常，所產(chǎn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育良好。5、免疫效果確實(shí)。 經(jīng)仔豬免疫保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)，滅活疫苗免疫初產(chǎn)懷孕母豬兩次，新生仔豬吮食一天初乳后，用大腸桿菌強(qiáng)毒 C83

5、902 （K88ac+、ST+和LT+）株攻擊新生仔豬，均獲得了 較好的免疫保護(hù)： 保護(hù)率為 9097.4%，比未免疫組高 16.17% ，平均日增重提高 40g 。三、安全試驗(yàn)、效力試驗(yàn)及推廣應(yīng)用效果情況1安全試驗(yàn)(1) 倍量接種安全試驗(yàn)于不同豬場(chǎng)隨機(jī)選取妊娠母豬200頭，于臨產(chǎn)前1520天，頸部肌肉注射本疫苗， 每頭10 mL,分兩側(cè)注射。所有免疫接種的妊娠母豬均無任何不良反應(yīng)，也無流產(chǎn)、 死胎和胎兒畸形等現(xiàn)象，妊娠母豬分娩正常，所產(chǎn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育良好。(2) 田間擴(kuò)大安全試驗(yàn)采用5個(gè)批次疫苗，試驗(yàn)?zāi)肛i分別于產(chǎn)前3035日和1520日各頸部肌肉注射疫 苗5mL，觀察至分娩。約35日觀察期內(nèi)，

6、試驗(yàn)?zāi)肛i的臨床表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)精神沉 有厭食或注射局部變化，體溫正常。5批疫苗使用的總體情況顯示，疫苗免疫母豬所產(chǎn)仔豬健康，疫苗的使用對(duì)免疫豬 的產(chǎn)仔率沒有影響。5批疫苗共免疫母豬1299頭，共產(chǎn)仔13627頭，疫苗免疫母豬平 均產(chǎn)仔10.5頭左右；對(duì)照組共設(shè)置母豬126頭，共產(chǎn)仔1249頭，對(duì)照母豬平均產(chǎn)仔 9.9頭左右。2、效力試驗(yàn)(1) 免疫攻毒表1新生仔豬吮食初乳4 h后攻毒保護(hù)率對(duì)比妊娠母豬每頭第一次第二次仔豬出生后吮食初免疫劑量免疫時(shí)間免疫時(shí)間乳4h后攻毒保護(hù)率2.5 mL產(chǎn)前 30產(chǎn)前 1583.9% (47/56)5.0mL3520 d95.8% (46/48)表2 不同哺乳

7、時(shí)間仔豬攻毒保護(hù)率對(duì)比(2) 田間免疫效果試驗(yàn)疫苗 批號(hào)吃乳時(shí) 間(日)組別攻毒數(shù)量(頭)存活數(shù)量(頭)保護(hù)率/存活率(%)2009021試驗(yàn)組201785對(duì)照組10007試驗(yàn)組201995對(duì)照組1011014試驗(yàn)組201995對(duì)照組1022028試驗(yàn)組2020100對(duì)照組10220在遼寧瑞嘉原種豬場(chǎng)進(jìn)行的田間試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組(免疫 K88ac-ST1-LTB三價(jià)滅 活疫苗)比對(duì)對(duì)照組(未免疫)保護(hù)率高 38.22%，仔豬成活率高16.17%,平均日增重 高0.08 Kg。表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。(3) 區(qū)域免疫效果試驗(yàn)于遼寧、河北、山東、黑龍江、吉林等地豬場(chǎng)隨機(jī)選取妊娠母豬650頭，于產(chǎn)前303

8、5 d和1520 d，經(jīng)頸部肌肉注射各免疫1次，每頭5 mL。免疫母豬共產(chǎn)仔豬7156頭，發(fā)生新生仔豬大腸桿菌性腹瀉126頭，發(fā)病率為1.76%，死亡21頭，死亡率為0.29%,對(duì)照組發(fā)病率為 40.29%(139/345)、死亡率為20.58%(71/345)，兩組的發(fā) 病率和死亡率均呈極顯著差異(P0.01)3、推廣應(yīng)用情況依據(jù)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部獸用生物制品臨床試驗(yàn)批件，201002號(hào)， 于2010年0211月在遼寧省黑山縣、遼陽市、海城市、建平縣、營(yíng)口市 5個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行 了區(qū)域性臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下。(1) 5個(gè)豬場(chǎng)的試驗(yàn)仔豬與對(duì)照仔豬的發(fā)病數(shù)據(jù)顯示，試驗(yàn)組共產(chǎn)仔豬13627

9、頭,發(fā)生黃白痢腹瀉試驗(yàn)仔豬的數(shù)量為 667頭，試驗(yàn)仔豬發(fā)生黃白痢腹瀉的數(shù)量占試驗(yàn)組仔 豬總數(shù)量的4.89% (667/13627);對(duì)照組共產(chǎn)仔豬1249頭，對(duì)照仔豬發(fā)生黃白痢腹瀉的 數(shù)量為127頭，發(fā)生黃白痢腹瀉對(duì)照仔豬的數(shù)量占對(duì)照組仔豬總數(shù)的10.17% 127/1249)，試驗(yàn)仔豬的發(fā)病率較對(duì)照仔豬的發(fā)病率低了5.28個(gè)百分點(diǎn)。(2) 5個(gè)豬場(chǎng)對(duì)發(fā)生黃白痢腹瀉的仔豬進(jìn)行投藥治療后，試驗(yàn)組 667頭仔豬發(fā)生黃 白痢腹瀉死亡86頭，占發(fā)生黃白痢仔豬數(shù)量的12.89% (86/667);對(duì)照組仔豬127頭發(fā) 生黃白痢腹瀉死亡23頭，占發(fā)生黃白痢仔豬數(shù)量的18.11% (23/127)。試驗(yàn)組仔

10、豬黃白 痢的發(fā)生率降低的同時(shí)，伴隨著抗生素的治療后，試驗(yàn)仔豬較對(duì)照仔豬的黃白痢死亡率低了 5.22個(gè)百分點(diǎn)。(3) 5個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)的母豬全部分娩正常，新生仔豬全部健活。 5個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)新生試 驗(yàn)仔豬13627頭，其中包括各種死因在內(nèi)共死亡 919頭，試驗(yàn)組仔豬斷奶存活12708頭， 斷奶存活率為93.26% (12708/13627 )，5個(gè)對(duì)照豬場(chǎng)新生對(duì)照仔豬1249頭，其中包括各 種死因在內(nèi)共死亡99頭，對(duì)照仔豬斷奶存活1150頭，斷奶存活率為92.07( 1150/1249)。 斷奶后仔豬存活率較對(duì)照仔豬的存活率高出 1.19個(gè)百分點(diǎn)。四、效益分析產(chǎn)仔 數(shù)/胎發(fā)病 率(%發(fā)病 數(shù)治療 費(fèi)用/

11、 頭治療 費(fèi)用病死 率(%病死 數(shù)仔豬 成本病死 損失合計(jì)減少 損失對(duì)照1010.171.026.006.1018.110.1823042.3648.4631.03免疫104.890.496.002.9312.890.0623014.5017.43說明：根據(jù)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，假設(shè)一頭母豬按單胎產(chǎn)仔10頭，仔豬成本230元/頭,跟胎免疫后新生大腸桿菌性腹瀉發(fā)病率由10.17%降到4.89%，藥物治療后大腸桿菌腹瀉病死率由18.11%降到12.89%,治療費(fèi)用節(jié)省支出3.17元，治療后因病致死減少0.12頭, 降低損失27.86元。按現(xiàn)市場(chǎng)成本計(jì)算，每頭母豬免疫疫苗后間接產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益累計(jì) 31.03 元。五、疫苗使用說明1、