探討GnIH參與母豬生殖調控的可能機制

1、探討GnIH參與母豬生殖調控的可能機制0 、引言促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是 Tsutsui 等于 2000 年在鵪鶉下丘腦內分離到的一種神經肽，哺乳動物的類似物為 RF 酰胺相關肽（RFRP）。具有抑制促性腺激素分泌和影響性行為、攝食、生長激素分泌等作用。豬作為中國重要的家畜之一，繁殖能力是決定其養(yǎng)殖經濟效益的主要因子。因此，研究 GnIH/ RFRP對母豬生殖調控的機理具有重要的理論意義和經濟價值。國內外已對鳥類、魚類、兩棲類及人、鼠、猴、牛、羊等的 GnIH 及其受體的基因克隆、分布定位和生理功能做了大量研究。已有研究顯

2、示，GnIH/RFRP 通過其受體發(fā)揮作用，其特異性受體為 GPR147，為具有 7 次跨膜結構域的 G 蛋白耦聯受體（GPCR）。關于 GnIH 分布的研究，主要集中在腦部，GnIH 在外周分布的研究相對較少。有報道顯示GnIH mRNA 除在中樞神經系統有表達外，在眼、卵巢、睪丸、脾、腎等外周組織中也有表達。除了下丘腦和垂體，GnIH 及其受體已被證實在許多鳥類的性腺中分布，并通過旁分泌或自分泌的形式參與生殖調控10。此外，GnRH 和 GnIH 的信號通路存在相互作用11-12。目前，有關 GnIH 對哺乳動物生殖功能調控的研究較少，且尚未見對豬的研究報道。本文對GnIH mRNA 在母

3、豬體內的表達模式，不同劑量 GnIH 對卵巢顆粒細胞類固醇激素分泌和增殖相關蛋白表達的影響，以及GPR147 與GnRH 的形態(tài)學關系進行了研究，從分子和蛋白水平入手，旨在探討 GnIH 參與母豬生殖調控的可能機制，為全面而深入地研究GnIH 生理功能提供理論基礎。1、 材料與方法試驗于 2010 年 10 月至 2012 年 11 月，在南京農業(yè)大學農業(yè)部動物生理生化重點實驗室及南京農業(yè)大學動物科技學院實驗中心完成。1.1 試驗動物及材料30 日齡健康蘇鐘仔母豬 7 頭，體重為（10±2）kg，購自江蘇省農科院蘇鐘種豬場。試驗動物經頸總動脈放血處死，4 頭動物立刻取其延髓、腦橋

4、、中腦、大腦、小腦、下丘腦、海馬、嗅球、脊髓、垂體、心、脾、腎、腎上腺、胃、眼球、卵巢、子宮、肝、腸（十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸）、腰大肌、膽囊和膀胱，迅速投入液氮冷凍，然后轉入-70凍存，用于GnIH 表達研究。3 頭動物取其下丘腦，按照文獻13的方法固定下丘腦和制作腦片，用于GnRH和GPR147定位研究。卵巢樣品采自 36 頭三元雜交長白青年母豬，體重（90±5）kg，均來自江蘇省天環(huán)食品有限公司。宰殺后，打開腹腔取出兩側卵巢。按照文獻14的方法分離培養(yǎng)卵巢顆粒細胞。6 孔細胞板中加入 1×106個/mL 的卵巢顆粒細胞懸液，37靜置培養(yǎng) 72 h 后，棄

5、去培養(yǎng)液，加入 10-6、10-8、10-10和 10-12mol·L-1GnIH 靜置培養(yǎng) 24 h 后，收集上清，-20保存，用于放射免疫法檢測 E2和 P4的濃度；處理后的卵巢顆粒細胞用蛋白裂解液裂解后，收集于 EP 管，-20保存用于 Westernblotting。1.2 主要試劑與儀器Trizol、反轉錄酶（M-MLV）、RNA 酶抑制劑（RNase inhibitor）、dNTPs、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo d（t）18）、rTaq DNA 聚合酶、SYBR PremixEx Taq Kit 購自 Takara 公司；DMEM/F12、D-Hanks、胎牛

6、血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購自南京維森特生物有限公司；40%Acr-Bis（391）、TEMED、麗春紅染色液、western 細胞裂解液、超敏 ECL 化學發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、鼠抗羊 IgG、PVDF膜、厚濾紙購自碧云天生物技術研究所。兔抗人 NPFF-1R（GPR147）（185-203）（H）多克隆抗體，貨號：H-001-58，Phoenix Pharmaceuticals，USA；羊抗 GnRH，cyclin B1，PCNA 和 β-actin，購自 SANTA CRUZ，USA；驢抗山羊羅丹明（TRITC）標記的熒光二抗和驢抗兔異硫氫酸熒光黃標記的熒光二抗

7、（FITC）（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA），正常驢血清（Jackson，WestGrove，PA，USA），購自上?；蚬?；人 RFRP-3（GnIH）（貨號：No. 048-46，Phoenix Pharmaceuticals，USA）；P4和 E2放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術研究所。ABI PRISM 7300 實時熒光定量 PCR 儀為美國 ABI公司產品；制膠器、垂直電泳槽、半干轉印儀為美國Bio-red 公司產品；激光共聚焦顯微鏡為德國 zeiss 產品。1.3 試驗方法及步驟1.3.1 半定量

8、 RT-PCR 母豬 24 個組織的總 RNA 提取按照 Trizol 試劑說明書在無 RNA 酶的環(huán)境下進行。提取的 RNA 進行均一性和完整性檢測。RNA 在無RNA 酶的環(huán)境下按兩步法進行逆轉錄。以 GAPDH 為cDNA 合成及 PCR 內源性參照，用混合樣品（取各待測樣品 cDNA 等量混合）作為模版，分別對 PCR 反應條件和循環(huán)圈數進行優(yōu)化，建立最佳 PCR 反應條件和校正不同批次間RT和PCR效率的差異。取20 ?L PCR產物在 2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外光下顯示 DNA 條帶并照相。用 Kodak ID 凝膠圖像分析系統分析條帶灰度，根據目的基因 GnI

9、H 和內參GAPDH 的 PCR 產物的灰度比，確定各樣品組織中的GnIH mRNA 表達的相對含量。1.3.2 放射免疫測定 所有卵巢顆粒細胞培養(yǎng)液中E2和 P4的含量均用同一批 I125標記的 E2和 P4放射免疫試劑盒檢測。E2的測定范圍：85 000 pg·mL-1；靈敏度：2 pg·mL-1；批內變異系數（CVw）10%；批間變異系數（CVb）15%。P4的測定范圍：0.2100ng·mL-1；靈敏度：0.1 ng·mL-1；批內變異系數（CVw）6.7%；批間變異系數（CVb）9.4%。1.3.3 Western blotti

10、ng 測定 Western blotting 按標準實驗步驟進行，SDS-PAGE 電泳，轉膜，麗春紅染色，封閉，孵育一抗，孵育二抗，加入 ECL 化學發(fā)光液，按時曝光，掃描膠片進行灰度分析。其中，一抗羊抗 PCNA 稀釋比 1200，Cyclin B1 稀釋比 1200，β-actin 稀釋比 11 000，二抗羊抗兔 IgG 稀釋比 11 000。1.3.4 熒光雙標記 切片經 37恒溫箱干燥 3 h，洗滌，滅活內源性過氧化物酶，用正常驢血清的緩沖液封閉非特異性抗原。滴加抗 GPR147 特異性抗體（1400 稀釋）孵育。洗滌后用驢抗兔 FITC 熒光標記的二抗孵育。充分洗滌，抗

11、 GnRH 特異性抗體（1200稀釋）孵育，PBS 洗 3 次/5 min，再用驢抗兔 TRITC 標記的熒光二抗孵育，充分洗滌后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。1.4 統計學處理結果均以平均數±標準誤（Mean ± SE）表示。數據處理應用 SPSS 11.0 統計軟件統計，同一處理不同濃度之間的比較采用單因子方差分析（one-wayANOVA），LSD 檢驗各組之間的差異顯著性。檢驗結果以 P0.05 為差異顯著，P0.01 為差異極顯著。2、 結果2.1 GnIH mRNA 在母豬 24 個組織中的表達根據目的基因 GnIH 和內參 GAPDH 的 PC

12、R 產物條帶（圖 1-A 和 B）灰度比，分析得出 GnIH mRNA在母豬各器官組織中的表達情況為：高豐度表達組織（GnIH 與 GAPDH 灰度比大于 0.1）：間腦、延髓、腦橋、中腦和嗅球。中豐度表達組織（GnIH 與 GAPDH灰度比小于 0.1 大于 0.025）：大腦皮質、海馬、眼、子宮、卵巢和膽囊。低豐度表達組織（GnIH與GAPDH灰度比小于 0.025 大于 0）：小腦、垂體、脊髓、腎上腺、腰大肌和腸。無表達組織：心、腎、脾、肺、胃、肝和膀胱（圖 1-C）。2.2 GnIH 對豬卵巢細胞類固醇激素釋放的影響GnIH 影響體外培養(yǎng)豬卵巢顆粒細胞類固醇激素的釋放。如圖 2 所示，

13、10-6和 10-10mol·L-1GnIH 能極顯著地抑制雌二醇的分泌（P0.01），其他劑量組差異不顯著。如圖 3 所示，不同劑量（10-6，10-8，10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 對孕酮的分泌與對照組相比無顯著性差異。2.3 GnIH 對豬卵巢細胞增殖相關蛋白表達的影響cyclin B1 的免疫印跡顯示單一條帶，為 55 kD。研究了不同劑量 GnIH 對母豬卵巢顆粒細胞中 cyclinB1 表達的影響，結果顯示，與對照組相比對，所有劑量組中只有 10-6mol·L-1GnIH 對 cyclin B1 的表達具有極顯著的抑制作

14、用（圖 4）（P0.01），其他劑量組（10-8、10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 對卵巢顆粒細胞cyclin B1 的表達影響不顯著。PCNA 的免疫印跡顯示單一條帶，為 36 kD。研究結果顯示，不同劑量的 GnIH 對母豬卵巢顆粒細胞中 PCNA 的表達均具有顯著的抑制作用（圖 5）。低劑量組（10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 能極顯著抑制PCNA 的表達（P0.01），抑制作用強于高劑量組（10-6和 10-8mol·L-1GnIH）（P0.05）。2.4 GPR147 與 GnRH 的共存關系本研究結果顯示，G

15、PR147 與 GnRH 在視前區(qū)及室旁核可見有陽性胞體與胞體或纖維密切接觸（圖 6）。3、 討論3.1 GnIH 與下丘腦-垂體-性腺軸目前的研究顯示，GnIH 及其受體不僅在下丘腦-垂體-性腺軸有分布，而且 GnIH 可在下丘腦、垂體和性腺 3 個水平調控生殖相關激素的合成和分泌。因此GnIH 對生殖調控的相關研究主要集中在下丘腦-垂體-性腺軸。GnIH 在下丘腦對生殖的調控主要是通過對下丘腦中生殖相關神經肽（如GnRH、褪黑激素和kisspeptin等）的相互調節(jié)完成的。GnIH 與 GnRH 在羊下丘腦的形態(tài)學研究顯示，GnIH 與 GnRH 在視前區(qū)有突觸接觸。GnIH 對 GnRH

16、 影響的電生理學研究顯示，GnIH 能抑制雌性和雄性大鼠腦片中 49% 的細胞GnRH 的釋放頻率。有研究提出 GnRH 并不是下丘腦中唯一能夠調控促性腺激素的作用因子，kisspeptin 和 GnIH 也能在下丘腦中調控促性腺激素的釋放，并且 kisspeptin 和 GnIH 互為拮抗物，共同調節(jié)下丘腦中 GnRH 的合成和分泌。GnIH 在垂體水平參與動物生殖的調控，主要是通過影響促性腺激素的合成和釋放。2000 年，Tsutsui等首次分離到 GnIH 時，即通過體外試驗發(fā)現這種神經肽能抑制垂體前葉 LH 和 FSH 的分泌，此外，免疫組織化學法研究證明 GnIH-ir 神經元投射到

17、下丘腦中最接近垂體的位置ME。GnIH 在性腺對生殖的調控主要體現在對排卵的調控，參與性腺的發(fā)育等。已有的研究顯示，當排卵前 LH 峰到來時，下丘腦 GnIH 神經元的數量和 GnIH在卵巢中的表達均降低，證明 GnIH 參與調控動物的排卵。Singh 等研究發(fā)現 GnIH 可影響小鼠卵巢的組織學變化，與健康卵泡相比，給小鼠體內服用 GnIH 后，卵泡中出現異常和退化的黃體，卵巢顆粒細胞核濃縮或者肥大、卵巢膜細胞肥大或形成空泡，卵母細胞的細胞形態(tài)也出現異常，提示 GnIH 可能參與調控卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡。關于 GnIH 在生殖調控方面的研究才剛剛開啟，其調節(jié)作用機制尚不清楚，在哺乳動物研

18、究尚未深入。本試驗針對母豬，從性腺水平入手探討GnIH 的微調作用。3.2 GnIH mRNA 在母豬各組織中的表達目前，人們已研究了許多動物 GnIH 及 GPR147mRNAs 在組織中的表達情況。Ikemoto 和 Park 研究發(fā)現雞 GnIH mRNA 僅在間腦表達，其受體則在間腦、端腦、視頂蓋中表達，在卵巢中無表達。但是Maddineni 等利用不同的 PCR 引物和步驟則從雞的卵巢和睪丸中擴增出 GnIH 受體片段。在日本鵪鶉，GnIH 受體在間腦、端腦、中腦、脊髓及垂體中有表達。最近，Zhang 等研究發(fā)現 GnIH mRNA 主要表達于斑馬魚的中樞神經系統、眼、卵巢和睪丸，在

19、脾、腎中有少量表達。在哺乳動物，僅在人和大鼠做了相關的表達研究。Hinuma 等研究發(fā)現 GnIH mRNA 在大鼠下丘腦、眼及睪丸，GPR147 mRNA 在垂體、睪丸、卵巢及胎盤中高表達。但是 Bonini 等卻得出不一樣的結論，他研究了 GPR147 mRNA 在人 24 個組織及大鼠 41 個組織中的表達情況，結果顯示 GPR147mRNA 除了在中樞神經系統中高表達外在許多外周組織如脾、腎、腸等也有較高豐度的表達。不同物種的研究結果可能由于引物條件或種屬特異性導致結果不太一致，但是 GnIH 及 GPR147 mRNAs 在中樞神經系統和生殖系統具有高表達則是物種間保守的。本研究結果

20、也印證了這一點，豬 GnIH 及 GPR147 mRNAs主要在中樞神經系統中表達，且豐度較高，在卵巢和子宮呈中等表達，提示 GnIH 可能通過中樞調控動物的生殖活動。值得注意的是 GnIH 及 GPR147 mRNAs均在下丘腦表達豐度最高，GPR147 mRNA 在垂體的表達豐度僅次于下丘腦，提示 GnIH 及其受體可能具有多種生理功能，GnIH 可通過其受體在下丘腦水平影響 GnRH 來參與動物的生殖調控。在垂體水平，GnIH可通過其受體調控垂體前葉促性腺激素的合成和釋放。此外，GnIH 及 GPR147 mRNAs 在卵巢及子宮中也有中等以上程度的表達，提示 GnIH 也可能在卵巢水平

21、調控性激素的合成釋放或者參與卵泡的募集等一系列生殖活動。GnIH 及其受體 mRNA 還在腎上腺、腎及腸道中表達，推測 GnIH 系統可能還參與應激和攝食等生理活動，但目前尚無豬 GnIH 在應激和攝食等方面的研究報道。3.3 GnIH 對母豬卵巢類固醇激素分泌的影響在母豬卵巢水平，已有研究證實 GnIH 及其受體在卵巢中分布，而且它們在生殖周期不同時期的表達也呈現規(guī)律性波動，提示 GnIH 在母豬卵巢水平可通過旁分泌或自分泌形式調控性激素的分泌、卵泡的發(fā)育等，從而參與母豬的生殖調控。本試驗深入探討了GnIH對體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞性激素分泌的影響，研究發(fā)現 GnIH 能顯著抑制卵巢顆粒細胞中

22、E2的分泌，但對 P4的分泌影響并不顯著。Oishi 等最新的研究發(fā)現與本研究結果一致，RFRP-3 能顯著抑制FSK、LH 和 FSH 誘導的 P4的分泌，但卻對8-Br- cAMP（8-bromoadenosine 3′5′-cyclic monophosphate）誘導及基礎分泌的 P4影響并不顯著，此外，加入雙功能的GPR147 阻斷劑 RF9 或者 GPR147 siRNA 后 P4的分泌則顯著上升。目前，GnIH/RFRP-3 在卵巢水平參與動物生殖調控的研究較少，GnIH/RFRP-3 在卵巢的生理功能和作用機制尚不明確，還需要更多更深入的研究。3.4 GnIH 對母豬卵巢顆粒細胞凋亡相關蛋白表達的影響本試驗首次證明了 GnIH 能在哺乳動物卵巢中抑制細胞周期蛋白的表達。有研究顯示 cyclin B1 及PCNA 分別參與了卵巢細胞有絲分裂 S 期和 G1 后期細胞的增殖和轉化。本研究發(fā)現 GnIH 能抑制卵巢顆粒細胞中周期蛋白 cyclin B1 及 PCNA 的表達。因此，推測 GnIH 可能通過影響卵巢顆粒細胞的細