(整理)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(最新整理)

1、精品文檔聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定義 1：用引物和 dna 聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增特定的 dna 區(qū)域的一種技術(shù)。應(yīng)用學(xué)科：生態(tài)學(xué)（一級學(xué)科）；分子生態(tài)學(xué)（二級學(xué)科）定義 2：體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術(shù)。應(yīng)用學(xué)科：水產(chǎn)學(xué)（一級學(xué)科）；水產(chǎn)生物育種學(xué)（二級學(xué)科）定義 3：通過 dna 互補(bǔ)雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來擴(kuò)增 dna特定序列的方法。應(yīng)用學(xué)科：細(xì)胞生物學(xué)（一級學(xué)科）；細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)（二級學(xué)科）定義 4：由穆利斯(k. b. mullis)于 1988 年首創(chuàng)的一種在體外模擬發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)的 dna 快速擴(kuò)增特定基因或 dna 序列的復(fù)制過程的技術(shù)。應(yīng)用學(xué)科：遺傳學(xué)（一級學(xué)科）；分子

2、遺傳學(xué)（二級學(xué)科）以上內(nèi)容由全國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會審定公布求助編輯百科名片精品文檔概述dna 聚合酶（dnapolymerase i）最早于 1955 年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的 klenowfragment of e. coli 則是于 70 年代的初期由 dr. h. klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性，因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。現(xiàn)今所使用的酶(簡稱 taq polymerase),則是于1976 年從溫泉中的細(xì)菌（嗜熱菌）（thermusaquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80 年代之

3、后。pcr 最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于 1971 年由 dr. kjell kleppe 提出。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復(fù)制（類似pcr 前兩個周期反應(yīng)）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的pcr 則于 1983 由 dr. kary b. mullis 發(fā)展出的，dr. mullis 當(dāng)年服務(wù)于 pe 公司，因此 pe 公司在 pcr 界有著特殊的地位。dr. mullis 并于 1985 年與 saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，pcr 的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后 pcr 技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，

4、成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。mullis 也因此獲得了 1993 年諾貝爾化學(xué)獎。pcr 原理dna 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈 dna 在多種酶的作用下和接近沸點(diǎn)的溫度下加熱可以變性解旋成單鏈，在dna 聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，dna 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 dna 的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，因為 dna 聚合酶需要一小段雙鏈 dna 來來引導(dǎo)雙鏈的合成。事實上，新合成的鏈的起點(diǎn)是由加入在反應(yīng)混合物中的一對寡核苷酸也就是引物在模板鏈兩端的退火位點(diǎn)決定再加上 d

5、na 聚合酶、dntp 就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，dna 聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的 dna 聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約技了 pcr 術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱 dna 聚合酶-taq 酶對于 pcr 的應(yīng)用有里程碑的意義， 該酶可以耐受 90以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使pcr 技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，pcr 技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。pcr 技術(shù)的基本原理類似于 dna 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。pcr 由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成模板 dna 的變性：模板 dn

6、a 經(jīng)加熱至 93左右一定時間（一般為 2030 秒）后，使模板 dna 雙鏈或經(jīng) pcr 擴(kuò)增形成的雙鏈dna 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板 dna 與引物的退火(復(fù)性)：模板 dna 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55左右，引物與模板 dna 單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合引物的延伸：dna 模板-引物結(jié)合物在 taqdna 聚合酶的作用下， 以 dntp 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 dna 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，每完成一個循環(huán)需 24 分鐘，23 小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。pcr 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件1

7、.標(biāo)準(zhǔn)的 pcr 反應(yīng)體系pcr 反應(yīng)五要素：參加 pcr 反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(pcr 引物為 dna 片段，細(xì)胞內(nèi) dna 復(fù)制的引物為一段rna 鏈)、酶、dntp、模板和緩沖液（其中需要 mg2+)。引物的多種設(shè)計方法，與 pcr 在實驗中的目的決定。但基本原則相同長產(chǎn)物片段與短產(chǎn)物片段引物延伸所獲得的新片段最初長短是不整齊的，分為長和短二種。短的是嚴(yán)格的限定在二個引物 5 端之間的，這正是需要擴(kuò)增的片段，而長的帶有不需要的尾巴。長和短產(chǎn)生原因是引物所結(jié)合的模板不同而造成的。以一個拷貝的原始模板為例，也就是只有一條待擴(kuò)增的雙鏈 dna鏈。長產(chǎn)物片段：在第一個反應(yīng)周期中，以二條互

8、補(bǔ)的 dna 鏈為模板， 引物從 3 端延伸。延伸片段的 5 端是一端人工合成的引物。是特定的， 但是 3 端沒有特定的止點(diǎn)。進(jìn)入第二個周期，引物除與原始模板結(jié)合外，還要與新和成的鏈，也就是長產(chǎn)物片段，結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的 5 端是固定的，就等于這次延伸的片段 3 端被固定了止點(diǎn)。保證了新片段是起點(diǎn)和終點(diǎn)都限定于引物結(jié)合位點(diǎn)以內(nèi)。成為長短一致的短片段。為什么短產(chǎn)物片段按指數(shù)增加，長產(chǎn)物片段按算數(shù)倍數(shù)增加呢？由于半保留復(fù)制，不斷產(chǎn)生新的長產(chǎn)物片段，引物一結(jié)合，就成為短的產(chǎn)物片段。所以長產(chǎn)物片段幾乎可以忽略不計。所以 pcr 反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化。就能保證足夠純的所需擴(kuò)增的 d

9、na 片段。用于進(jìn)一步分析和研究。是按照與擴(kuò)增區(qū)段兩端序列彼此互補(bǔ)原則設(shè)計的。所以每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點(diǎn)開始，按到方向延伸。每一條新合成的鏈都具有新的引物結(jié)合位點(diǎn)。然后再加熱，進(jìn)入下一輪。隨著循環(huán)次數(shù)遞增新和成的引物延伸鏈急劇增多而成為主要的模板。所以將受到所加的引物末端的限定。其終產(chǎn)物序列是介于二種引物末端之間的區(qū)域。最后結(jié)果：pcr 所用的酶主要有兩種來源：taq 和 pfu。分別來自兩種不同的嗜熱菌。其中 taq 擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯配。pfu 擴(kuò)增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇模板即擴(kuò)增用的 dna，可以是任何來源，但有兩個原則，第一純度

10、必須較高，第二濃度不能太高以免非特異性增加，也就是合成不需要的 dna緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用 hepes 或 mops 緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有 dmso（對 dna 聚合酶 1klenow 片段是有益的，但對于 taq 聚合酶有抑制作用，所以一般反應(yīng)中不用，但是在復(fù)合 pcr 中使用）、甘油（加入 5%15%，有助于復(fù)性，尤其對 g+c 含量高和二級結(jié)構(gòu)多的靶序列，以及擴(kuò)增長片段，也就是大于 1500 堿基對更實用。但是并

11、不對所有的pcr 有益，所以要摸索），氯化甲基四銨tmac，（在反應(yīng)中加入 1*10 的副五次方1*10 的副四次方 mol/l 的 tmac 可促進(jìn) pcr 去除非特異性擴(kuò)增，而不抑制 taqdna 聚合酶）等，主要用來保持酶的活性和幫助 dna 接觸纏繞結(jié)構(gòu)這些輔助成分也叫添加劑，它可以消除引物和模板的二級結(jié)構(gòu)，降低dna 雙鏈的解鏈溫度，使 dna 雙鏈變性完全，可增進(jìn) dna 復(fù)性時的特意配對，增加或者改變dna 聚合酶穩(wěn)定性以提高pcr 擴(kuò)增效率。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不同溫度條件下添加劑會影響 taq 酶的半衰期。反應(yīng)加入小牛血清白蛋白 100 微克每毫升或明膠 0.01%，或者tween20,

12、0.050.1%有助于酶的穩(wěn)定。加入 5 豪摩爾的二硫蘇糖醇也有類似的作用尤其在擴(kuò)增片段長時，此時延伸時間也長，可加入這些酶保護(hù)劑。但是不能加入太多，否則會抑制 pcr 擴(kuò)增2、pcr 引物設(shè)計pcr 反應(yīng)中有兩條引物，即 5端引物和 3引物。設(shè)計引物時以一條 dna 單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段 5端上的一小段 dna 序列相同（與 3 撇端互補(bǔ)）；3端引物與位于待擴(kuò)增片段 3端的一小段 dna 序列互補(bǔ)。？引物設(shè)計的基本原則引物長度：15-30bp，常用為 20bp 左右。引物堿基：g+c 含量以 40-60%為宜，g+c 太少擴(kuò)增效果不佳， g+c 過多易出現(xiàn)

13、非特異條帶。atgc 最好隨機(jī)分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。最低限度是不能連續(xù)四個堿基互補(bǔ)兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免 3 端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過 70%，引物 3末端連續(xù) 8 個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物 3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是 g 和 c。引物 3端不可修飾。應(yīng)為保守序列。引物的 5 端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)， 用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。v 引物設(shè)

14、計軟件primer premier5.0 （自動搜索）* voligo6 （引物評價）vvector nti suit vdnasis vomiga vdnastarvprimer3 （在線服務(wù)）3、模板的制備pcr 的模板可以是 dna，也可以是 rna。但是 rna 擴(kuò)增需要先反轉(zhuǎn)錄成 cdna 才能進(jìn)行正常的 pcr 循環(huán)。模板的取材主要依據(jù) pcr 的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過 sds 和蛋白酶 k 處理。難以破碎的細(xì)

15、菌，可用溶菌酶加 edta 處理。所得到的粗制 dna，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作 pcr 反應(yīng)模板。？（可以不用純化而直接當(dāng)成模板？）此處需要打印：4、pcr 反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)體積：50 到 100 微升 反應(yīng)緩沖液：50mmol/l 氯化鉀，有利于引物的退火。如果大于該數(shù)值，則影響抑制 taqdna 聚合酶的活性。有些反應(yīng)中以 nh4 替代 k，其濃度為 16.6mol/l 10mmol/l 鹽酸100ng/ml 明膠鎂離子濃度 總應(yīng)比 dntps 的濃度高。是 1.5mmol/ltaq 聚合酶需要鎂離子。鎂離子影響引物的退火， 模板與 pcr 產(chǎn)物的溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體

16、的形成，主要是 pcr 混合物中的 dna 模板，引物和 dntp 磷酸集團(tuán)可與鎂離子結(jié)合。所以鎂離子含量降低。而 taq 聚合酶需要游離的鎂離子最好對每一種引物，每一種模板都進(jìn)行鎂離子的濃度優(yōu)化。如果引物和模板 dna 原液中含edta 等金屬螯合劑也會減低游離的鎂離子濃度。最為常用的緩沖體系：1050mmol/l，tris.hcl, tris 是一種雙極性離子緩沖液，改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將 tris 濃度加大到 50mmol/l，ph8.9，有時會增加產(chǎn)量。模板：0.1 微克，要根據(jù)具體條件加以調(diào)整。一般需 10010 的 5 次方拷貝的 dna底物濃度 dntp 以等摩爾濃度配制，2

17、0200umol/ltaqdna 聚合酶 2.5u（100ul）引物 濃度一般為 0.1 0.5umol/l用 0.2 毫升的 pcr 管，反應(yīng)體積最小為 5 微升，各反應(yīng)成分按比例縮反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時間 95，30s退火溫度和時間 低于引物 tm 值 5 左右，一般在 4555 延伸溫度和時間 72，1min/kb（10kb 內(nèi)）tm 值=4(g+c) +2(a+t)循環(huán)次數(shù) :一般為 25 30 次。循環(huán)數(shù)決定 pcr 擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為 30 個左右，循環(huán)數(shù)超過 30 個以后，dna 聚合

18、酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。、平臺效應(yīng)： 當(dāng)引物-模板與 dna 聚合酶達(dá)到一定比值時，dna 聚合酶催化反應(yīng)達(dá)到飽和，出現(xiàn)平臺效應(yīng)此處具有酶促反應(yīng)動力學(xué)出現(xiàn)遲早取決于，起始模板的拷貝數(shù)，所用 dna 聚合酶的性能， 以及底物 dntp 濃度等因素。平臺效應(yīng)不可避免，但是在其出現(xiàn)之前就可以得到足夠數(shù)量的目的基因。出現(xiàn)平臺期時，pcr 后期循環(huán)產(chǎn)物對數(shù)積累趨于飽和，并伴隨 0.31皮摩爾靶序列的積累。隨著循環(huán)次數(shù)增加，一方面產(chǎn)物濃度太高，一致自身結(jié)合，而不與引物結(jié)合?；蛘弋a(chǎn)物鏈糾纏在一起，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低。另一方面，酶活下降，引物及 dntp 濃度

19、下降，易發(fā)生錯誤摻入，非特異性產(chǎn)物增加。所以得到足夠產(chǎn)物時應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。例如當(dāng)按照常規(guī) pcr 程序合成人類基因時，其標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)加入 1 微克人類基因組 dna，一般從 1 毫升血樣中可以獲得 50 微克，。它應(yīng)含有平均長度為千堿基對的各種單拷貝序列分子的五次方，相當(dāng)于.皮克的個核苷酸長的靶 序列。經(jīng)過個循環(huán)后，便可產(chǎn)生微克擴(kuò)增片段。足以滿足任何一種分子生物學(xué)研究。包括直接的序列測定的需要。實驗表明，從微升擴(kuò)增反應(yīng)混合物中取微升，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下便可觀察到清晰的靶條帶。有人報道，即便反應(yīng)混合物中只含有一個拷貝的靶分子，也能有效的擴(kuò)增。也正因為有如此高的敏銳性，所以任何樣品或者實

20、驗試劑均應(yīng)仔細(xì)保存，以避免污染。pcr 的循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（initial denaturation）模板 dna 完全變性與 pcr 酶的完全激活對 pcr 能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的 taq 酶激活時間為兩分鐘。2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般 95，30 秒足以使各種靶 dna 序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。3、引物退火（primer annealing）退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的 tm 值為參考， 根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退

21、火溫度對 pcr 的特異性有較大影響。4、引物延伸引物延伸一般在 72進(jìn)行（taq 酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在 1000bp 以上，含 pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為 1min/kbp。5、循環(huán)數(shù)大多數(shù) pcr 含 25-40 循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。6、最后延伸在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在 72維持 5-15 分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。（四）pcr 中的污染和假陽性pcr 中污染主要來自1. 樣品間交叉污染；2. 先前 pcr 產(chǎn)物遺留（carry-over）現(xiàn)在有些 pcr 因為擴(kuò)增區(qū)很短，即使 taq

22、 酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在 60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。、pcr 檢測pcr 反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，eb）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。pcr 反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)pcr 反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板 dna 特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；taq dna 聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保

23、守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及 taqdna 聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高pcr 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(g=-6)水平。能從 100 萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，pcr 的靈敏度可達(dá) 3 個 rfu(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為 3 個細(xì)菌。簡便、快

24、速pcr 反應(yīng)用耐高溫的 taq dna 聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在dna 擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，dna 粗制品及 rna 均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等 dna 擴(kuò)增檢測。pcr 儀器pcr 儀器的發(fā)展 pcr 溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr 擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自 perkin elmercetus 公司第一臺 pcr 擴(kuò)增儀問世以來，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國內(nèi)外生產(chǎn)和銷售

25、 pcr 擴(kuò)增儀。在短短的幾年間，擴(kuò)增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。為了便于了解和選購適宜的 pcr 實驗設(shè)備，現(xiàn)將部分國內(nèi)外 pcr 擴(kuò)增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國產(chǎn) 1109 型 dna 擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b 體積小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式 pcr，方便實用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動控制溫度、時間及循環(huán)數(shù)，可以達(dá)到節(jié)省勞動力的目的。在采用這些儀器作 pcr 試驗之前，一般均應(yīng)實測管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況，

26、以了解升、降溫時管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度滯后情況和實際到達(dá)的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用 eppendorf 管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響， 這對變溫鋁塊式儀器影響更大些。對于配用制冷機(jī)式半導(dǎo)體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來保冷 pcr 反應(yīng)后小管時，應(yīng)注意冷凝水的問題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導(dǎo)體元件而損壞儀器。國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種 dna 擴(kuò)增儀1109 型北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合機(jī)械臂變溫水浴電子調(diào)溫400.5ml16400 元/臺90a/b 型中科院遺傳所機(jī)械臂變溫水浴電熱14000 元/臺ptc-51a/b 型軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院變溫氣流電子調(diào)兼作

27、套式300.5ml12000 元/臺dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 變溫鋁塊壓縮機(jī)致冷480.5ml us $ 20000.-thermocycler #60#00#180b.braun biotech (德)變溫水浴 98四檔電熱，自來水冷卻601.5ml1001.5ml1801.5ml dm 30000.-automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.(美)變溫鋁塊 25100電熱,自來水冷卻291.5ml581.5mlus $4985.- us $7980

28、.-grant autogengrant instrumant ltd(美)變溫水浴 099電熱，自來水冷卻或加冷循環(huán)器501.5mlor 501.5mlus $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2techne ltd.(英)變溫鋁塊 099三檔電熱 500w 水冷 100w 540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -bioovenbiothrm corp(美)變溫氣流-150 115v 11a200s of 496plate us $ 2990. -trio-thermo-block tb-1 biom

29、ertra(德) 半導(dǎo)體變溫220v320 管分別控溫dm12900. -micro cycler e eppendorf(美) 變溫鋁塊220v/100v329 管us $ 3500. -pcr 常見問題pcr 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶pcr 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， pcr 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有 taq 酶抑制劑， 模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板

30、時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。電泳檢測陰性。需注意的是有時忘加 taq 酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 pcr 失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 od 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條

31、帶，一條引物無條帶，此時做 pcr 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。mg2+濃度：mg2+離子濃度對 pcr 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低 pcr 擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響 pcr 擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr 擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 pcr 擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行 pcr 擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，

32、在做小體積如 20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對 pcr 擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，引物無法與模板結(jié)合，會導(dǎo)致 pcr 反應(yīng)的失敗。極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 pcr 擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 pcr 失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其 pcr 擴(kuò)增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的 pcr 擴(kuò)增條帶與目的靶

33、序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 pcr 擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的 pcr 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：屬于反應(yīng)前污染。這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。如提取dna 使用的儀器上殘留的雜質(zhì) dna 或反應(yīng)管中殘留的 pcr 產(chǎn)物， pcr 操作者的皮膚和頭發(fā)等，其中 pcr 產(chǎn)物的污染是引起樣品交叉污染的主要因素。明膠，taqdna 酶等 pcr 試劑均有可能帶有雜質(zhì)dna，所以也可導(dǎo)致 pcr 反應(yīng)前污染。這種假陽性

34、可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸?；蛘哂?10%的次氯酸鈉或者 2 摩爾每升的鹽酸浸泡或者擦洗污染源。前者效果更佳。限制性內(nèi)切酶含高鹽溶液，但是要必要時， 可以去除含酶切位點(diǎn)的 dna。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出 pcr 產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式 pcr 方法來減輕或消除。三是 pcr 反應(yīng)后污染，主要來自 pcr

35、 產(chǎn)物檢測過程，如電泳上樣， 點(diǎn)雜交點(diǎn)樣時加樣器吸頭之間的污染等。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶pcr 擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。引物二聚體是一種非模板依賴的雙鏈 pcr 產(chǎn)物。二是 mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 pcr 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量， 往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高

36、退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶pcr 擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dntp 濃度過高，mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少 dntp 的濃度。適當(dāng)降低 mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)?？寺?pcr 產(chǎn)物1) 克隆 pcr 產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比 1：8 或 8：1 也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用 5ul 2x連接液，50ng 質(zhì)粒 dna,1weiss 單位的t

37、4 連接酶，插入片段共 10ul。室溫保溫 1 小時，或 4過夜。在這 2 種溫度下，缺t-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫 1 小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需 4過夜。2) pcr 產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。如果引物濃度過高，就會產(chǎn)生引物二聚體。產(chǎn)生引物二聚體原理：反應(yīng)體系中引物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于模板量。摩爾比為 10 的八次方比、一。如此過量的引物才能確保模板一旦變性就與引物

38、復(fù)性，才不會與模板退火。則引物相互碰撞的幾率大，一旦形成引物二聚體，則它會非常有效的被擴(kuò)增，并有可能成為主要的 pcr 產(chǎn)物。一對引物的 3 端互補(bǔ)能促進(jìn)引物二聚體形成。即使二引物 3 端互補(bǔ)序列在低復(fù)性溫度，高酶濃度，高引物條件下，再加上循環(huán)次數(shù)多，任引物均可形成二聚體。所以引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20 攝氏度至少可保存 1224 個月。液體狀態(tài)于-20 攝氏度保存期為 6 個月。3) 如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？a） 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。b） 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效

39、率。例如，將 1ug/ul 質(zhì)粒 1:100 稀釋，1ul 用于 100ul 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用 soc 稀釋到 1000ul 后，用 100ul 鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生 1000 個菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板 dna 的總量。鋪板 dna 的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用 10ng dna，用 soc 稀釋到 1000u 后含 10 ng dna，用 1/10 鋪板，共用 1 ng dna。轉(zhuǎn)化率為：1000 克隆x10（3 次方） ng /鋪板1 ng dna ug=10（6 次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化 pgem-t 應(yīng)用 10（8 次方）cfu/ ug 感受態(tài)細(xì)胞

40、如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。c） 如用 pgem-t 正對照，或 pcr 產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40 藍(lán)斑（用指定步驟 10（8 次方）cfu/ug 感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去 t?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。t4dna 連接酶（m1801，m1804，m1794） 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的 t4 dna 連接酶替換。d） 用 pgem-t 或 pgem-t easy 載體，連接 pgem-t 正對照， 轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8 次方）cfu/ug），按照指定的實驗步驟，可得 100 個菌落，其中 60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40 藍(lán)斑，沒有菌落或少有菌落，連接

41、有問題。4) 對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？a） 連接用室溫保溫 1 小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率， 需 4過夜。b） 插入片段帶有污染，使 3-t 缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和 pgem-t 正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使 pgem-t 或 pgem-t easy 載體 3-t 缺失。c） 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受 uv 過度照射，時有發(fā)生。uv 過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接， dna 必需重新純化。d） 帶有修復(fù)功能的耐熱 dna

42、 聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無 a，后者是 pgem-t 或 pgem-t easy 載體克隆所需。加 taq dna 聚合酶和核苷酸可在末端加 a。詳情查 pgem-t pgem-t easy 載體技術(shù)資料（tm042）。e） 高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如 sure 細(xì)胞 加雙或三蒸水至 100uldntp 的質(zhì)量與濃度 dntp 的質(zhì)量與濃度和 pcr 擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dntp 粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dntp溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以 1m naoh 或 1m tris。h

43、cl 的緩沖液將其 ph 調(diào)節(jié)到 7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使 dntp 降解。在 pcr 反應(yīng)中，dntp 應(yīng)為 50200umol/l， 尤其是注意 4 種 dntp 的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低 pcr 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dntp 能與 mg2+結(jié)合，使游離的 mg2+濃度降低。因此， pcr 體系中鎂離子的加入量要比 dntp 濃度高0.22.5mmol/l。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是 pcr 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 dna 純化方法通常采用 sds 和蛋白酶

44、k 來消化處理標(biāo)本。sds 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，sds 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶 k 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 dna 結(jié)合的組蛋白， 再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 pcr 反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于 pcr 擴(kuò)增。rna 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 k 法，要防止 rnase 降解 rna。 退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響 pcr 特異性的較重要

45、因素。變性后溫度快速冷卻至 4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 dna 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于 20個核苷酸，g+c 含量約 50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：退火就是復(fù)性的意思，如果復(fù)性溫度太高，dna 鏈有的還都處于變性，引物就不愿意與之結(jié)合。相反，如果復(fù)性溫度低，dna鏈都復(fù)性，就會增加擴(kuò)增產(chǎn)量，但是其他非目的基因和模板本身的基因也會增加tm 值(解鏈溫度)=4(g+c)+2(a+t)復(fù)性

46、溫度=tm 值-(510)在 tm 值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高 pcr 反應(yīng)的特異性。退火也就是復(fù)性時間為 2040 秒，時間過短導(dǎo)致延伸不充分，后面延伸步驟中溫度升高，會導(dǎo)致引物從模板中脫落，pcr 反應(yīng)失敗。如果待擴(kuò)增目的 dna 片段含量很少，可在 pcr 前幾次循環(huán)中適當(dāng)延長退火時間有利于引物與模板的結(jié)合。提高靈敏度。延伸溫度與時間：taq dna 聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150 核苷酸/s/酶分子70 60 核苷酸/s/酶分子55 24 核苷酸/s/酶分子37 攝氏度1.5 核苷酸/s/酶分子高于 8090時， dna 合成幾

47、乎不能進(jìn)行。原因可能是高溫破壞引物-模板結(jié)合的穩(wěn)定性taq 酶基因全長 2499 個堿基， 編碼出蛋白質(zhì)分子質(zhì)量是94000da，長度為 832 個氨基酸。pcr 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 7075之間，常用溫度為 72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。pcr 延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般 1kb 以內(nèi)的 dna 片段，延伸時間 1min 是足夠的。34kb 的靶序列需 34min；擴(kuò)增 10kb 需延伸至 15min。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。擴(kuò)增小于 500 堿基對的，20 秒小于 150 堿基對的，則可以省略延

48、伸步驟。因為退火溫度下，taqdna 酶活性已足以完成短序列的合成taqdna 聚合酶： 1 無 35 外切酶活性：序列分析表明，taq酶與大腸桿菌聚合酶 1n 端區(qū)域高度同源，大腸桿菌聚合酶 i 具有 53 外切酶活性與此區(qū)域有關(guān)，因此 taq 酶也具有 53 外切酶活性。taq 酶沒有 35 外切酶活性，因為沒有與大腸桿菌聚合酶 i 的 35 外切酶活性區(qū)域同源的序列。pcr 反應(yīng)中，若發(fā)生單核苷酸的錯配，taq 酶無校對功能。該酶在 pcr 反應(yīng)中出現(xiàn)錯配的幾率是 1/3001/18000,也就是說，經(jīng)過 25 輪擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中每400 個堿基中就有一個堿基對與原始序列不同。這

49、對于大批量產(chǎn)物的分析而言，并不會構(gòu)成什么嚴(yán)重的問題，因為具有同樣錯誤摻入的核苷酸分子僅占全部參與合成的 dna 分子群體的極小部分。然而，如果如果 pcr 擴(kuò)增的 dna 片段是用于分子克隆，則核苷酸錯誤摻入是一個值得注意的問題。每一個克隆來自單一的核苷酸分子，如含有一個或者數(shù)個錯誤摻入的核苷酸，則在該克隆中所有克隆的 dna 都帶有同樣的“突變”，所以，對于目的是用來克隆的擴(kuò)增 dna，要測序。以便弄清發(fā)生的突變。當(dāng)然，通過克隆測序以及同一系列獨(dú)立擴(kuò)增的 dna 分子進(jìn)行比較，便能評估 pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物的精確性。所以如 vent 酶等其他擴(kuò)增反應(yīng)精確性很高的酶也可以考慮加入。反轉(zhuǎn)錄酶活性：類

50、似于反轉(zhuǎn)錄酶。在 23mmol/l 鎂離子，68 攝氏度時即能發(fā)揮此活性。有人報道，在有錳離子加入，活性更佳。如果沒有錳離子，就不能反轉(zhuǎn)錄 150250 個核苷酸以上的核酸，利用這一特性，可以直接進(jìn)行 rna 的擴(kuò)增，是 rt-pcr 簡化。taqdna 聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性的發(fā)現(xiàn)和一步法rt-pcr 的建立具有重要的實際意義。1dna 溶液，組織處理樣品，細(xì)胞間液，或者其他體液中的 rna應(yīng)該進(jìn)行處理，否則會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。2rt_pcr 可以直接用于 cdna 克隆3 可以分析異常的信使 rna，如過量表達(dá)，突變，轉(zhuǎn)位，外源基因的表達(dá)等4 有助于建立單體系的 rna 擴(kuò)增和序列分析系統(tǒng)。

51、并實現(xiàn)自動化。非模板依賴的聚合酶活性：taq 酶具有類 dna 末端轉(zhuǎn)移酶的功能，可以再新和成的雙鏈產(chǎn)物的 3端加上一個非模板依賴的堿基。盡管四種堿基均可以被聚合到 3 端，但是 taq 酶對 datp 的聚合能力遠(yuǎn)高于其他三種。所以，在標(biāo)準(zhǔn) pcr 反應(yīng)中，pcr 產(chǎn)物3 端這一非模板依賴堿基幾乎總是a。利用這種特性，可以構(gòu)建 dt-載體來克隆帶 da 尾的 pcr 產(chǎn)物，這種非模板依賴的聚合堿基還可以通過大腸桿菌聚合酶的片段處理去掉。即在反應(yīng)之后，在攝氏度加熱分鐘滅活 聚合酶。調(diào)整鎂離子濃度至，加入大腸桿菌聚合酶大片段。室溫下作用分鐘即可。如反應(yīng)中，每種為微摩爾每升，則不需再加入影響酶活性

52、的因素：taq 酶活性受許多因素的影響，如鎂離子，氯化鉀，醋酸銨等。氯化鎂濃度在 2.0 毫摩爾每升時酶活性最高，鎂離子濃度偏高，則活性收到抑制。pcr 反應(yīng)中的模板 dna，引物，以及四種寡核苷酸，均可與鎂離子結(jié)合，所以在不同體系中鎂離子濃度要適量調(diào)整。50 毫升的氯化鈉可提高 taq 酶的活性 2030%。另外，不同變形劑對酶活影響不同。了解這些特性對 pcr 反應(yīng)條件優(yōu)化有益處pcr 實驗室的建立方法1、實驗室布局pcr 實驗室按規(guī)定需要四間，分別是 1 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、2 標(biāo)本制備區(qū)、3 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)， 布局見圖 1。pcr 實驗室如果使用全自動分析儀，各區(qū)域可適當(dāng)合并，我們建議將擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)合并為擴(kuò)增檢測區(qū)即共三個間