人教版高中生物課件選修一血紅蛋白的提取與分離

1、思考,1,分離生物大分子的基本思路是什么,選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有,不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,思考,2,蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的,形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少,溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親,和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì),思考,3,高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì),的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞,變性、變性、空間結(jié)構(gòu),思考,4,人們用雞的紅細(xì)胞提取,DNA,用人,的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有,DNA,便于進(jìn)行,DNA,的提取，人的紅細(xì)胞無,細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐,富便于提取血紅蛋白

2、,一、基礎(chǔ)知識,凝膠色譜法（分配色譜法,1,凝膠,一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的,通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖,具多孔的凝膠就叫分子篩,2,概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對,分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝,膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離,3,原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相,對,相對分子質(zhì)量較小,的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入,凝膠內(nèi)部的通道，路程,較長,，移動速,度,較慢,，而,相對分子質(zhì)量較大,的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能,凝膠外部,移動，路程,較短,在,移動速度,較快,，相對分子質(zhì)量不同,的蛋白質(zhì)因此得以分離,大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快,小分子穿過多孔凝膠顆粒的

3、內(nèi)部，路程長，流動慢,混合物,上,柱,洗,脫,大分子流動快,小分子流動慢,收,集,大分子,收,集,小分子,洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動,緩沖溶液,1,概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外,來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液,PH,發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具,有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液,2,作用,能夠抵制,外界的酸或堿,的對溶液,的,PH,值,的影響，維持,PH,基本不變,3,緩沖溶液的配制,通常由,1,2,種緩沖劑溶解于水,中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的,使用比例,就可以制得,在不同,PH,范圍內(nèi),使用的,緩沖液,思考：說出人體血液中緩沖對,NaH2PO4 / N

4、a2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,思考：在血紅蛋白整個實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖,液是什么？它的目的是什么,使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖,液模擬細(xì)胞內(nèi)的,PH,環(huán)境，保證血紅蛋白,的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色,和材料的科學(xué)研究（活性,電泳,電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程,1,原理,不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）,電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用,力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在,電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同,思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷,在一定的,PH,下，蛋白質(zhì)可解離的基團(tuán)會帶上電荷,2,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

5、,決定,運(yùn)動方向,電荷性質(zhì),電場,作用力,形成,阻力,決定,運(yùn)動速率,電荷量,分子形狀,分子大小,1,原理,許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都,具有可解離的基團(tuán)，在一定的,PH,下，這些基,團(tuán)會帶上正電或負(fù)電,在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其,所帶電荷相反的電極移動,電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的,差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分,子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分,子的分離,2,常見方法,瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳,聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交,聯(lián)劑,N,N,甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑,過硫,酸銨和催化劑（四甲基已二胺）的作用下,聚合交聯(lián)成三

6、維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,測定,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量,通,常用十二烷基硫酸鈉,SDS,聚丙稀,酰胺凝膠電泳,應(yīng)用,十二烷基磺酸鈉,SDS,聚丙稀酰胺凝,膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量,原理,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它,所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素,SDS,作用,為了消除凈電荷對遷移率的影響可以在凝膠,中加入,SDS ,SDS,所帶負(fù)電荷的量大大超過了,蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種,電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決,于分子的大小,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于,它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素,為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠,SDS,SDS,能使蛋白質(zhì)發(fā)

7、生完全變性,中加入,由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在,SDS,的作用,下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是,SDS,能與各種蛋白質(zhì),單條肽鏈的分子量,形成蛋白質(zhì),SDS,復(fù)合物,SDS,所帶負(fù)電荷的,量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而,掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳,遷移率完全取決于,分子的大小,電泳檢測,PCR,結(jié)果,瓊脂糖凝膠電泳,二,實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步,樣品處理,粗分離,純化,純度鑒定,1,樣品處理,血漿,血,液,血細(xì)胞,水分,固體物質(zhì),白細(xì)胞,血小板,兩個,a,肽鏈,血紅,紅細(xì)胞,兩個一肽鏈,蛋白,最多,90,共四條肽鏈,血漿蛋白,無機(jī)鹽,磷脂,葡萄糖

8、等,每個肽鏈環(huán)繞,一個亞鐵血紅素基團(tuán),，此,一分子氧或一分子二氧化碳,基團(tuán)可攜帶,血紅蛋白因含有,血紅素,而呈紅色。本課,題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來,分離血紅蛋白,1,紅細(xì)胞的洗滌,目的：去除,雜質(zhì)蛋白,方法：,低速短時(shí)間,離心（速度越高和,時(shí)間越長會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá),不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層,透明的,，將下層,的紅,黃色血漿,細(xì)胞液體倒入,暗紅色,燒杯,再加入用,五倍體積,的,生理鹽水,質(zhì)量,分?jǐn)?shù)為,0.9,的氯化鈉溶液洗滌,低速離心（低速短時(shí)間,重復(fù),4,5,步驟,三,次，直至上清液中已,沒有,，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血,黃色,紅蛋白的分離純化，

9、不可洗滌次數(shù)過少,2,血紅蛋白的釋放,加,蒸餾水,到,原血液,體積,再加,40,體積的,甲苯,溶解細(xì)胞,膜,置于,磁力攪拌器,上充分?jǐn)嚢?10,分鐘（加速細(xì)胞破裂,細(xì)胞破裂釋放出,血紅蛋白,3,分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn),移到離心管內(nèi)，以,2000r/min,的速度離心,10,min,試管中的溶液分為,4,層,第,1,層（最上層,無色透明,甲苯層,第,2,層（中上層,第,3,層（中下層,第,4,層（最下層,脂溶性物質(zhì),的沉淀層,白,色薄層固體,血紅蛋白,的水溶液層,紅色透明,的液體,其它雜質(zhì),暗紅色,的沉淀層,用濾紙過濾,除去脂溶性沉,淀層，于分液,漏斗中靜置片,刻后，分出下,層的紅色

10、透明,液體,4,透析,透析袋,取,)ml,的血紅蛋白溶液裝入,1,中，將透析袋放入盛有,300ml,的物質(zhì)的量,濃度為,20mmol/L,的,磷酸緩沖液,中,pH,為,7.0,，透析,12,小時(shí)，目的是,除去樣品中分子量較小的雜質(zhì),或用,于更換樣品中的,緩沖液,。透析袋一,般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙,2,凝膠色譜制作,1,凝膠色譜柱的制作,取長,40,厘米，內(nèi)徑,1.6,厘米的玻璃,管，兩端需用砂紙磨平,底塞的制作：打孔,挖出凹穴,安裝移液管頭部,覆蓋尼龍網(wǎng)，再用,100,目尼龍紗包好,a,選擇合適的的橡皮塞,中間打孔,b,在橡皮塞頂部切出鍋底狀的,凹穴,，在,0.5ml,的,移液管,頭部

11、切,下,5cm,長的一段，插入橡皮塞孔內(nèi),上部不得超過橡皮塞的凹穴底面,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮,塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還,會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底,c,剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在,橡皮塞的凹面,上，用,100,目,的尼龍紗將橡皮塞,上部,包好，插到玻璃管一端,d,色譜柱下端用移液頭部做,連接一細(xì)的,，并用螺旋夾,出口部位,控制尼龍管的,，另一端放,尼龍管,入收集,的收集器內(nèi),打開與關(guān)閉,色譜流出液,頂塞的制作,插入安裝了玻璃管的橡皮塞,組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體,安裝其他附屬結(jié)構(gòu),2,凝膠色譜柱填料的處理,1,凝膠的選擇,交聯(lián)葡聚糖凝膠,G-75,G”

12、表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度,及分離范圍,75,表示凝膠的得水值，即每克凝膠,膨脹時(shí)吸水,7.5,克,2,方法,配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量,的凝膠浸泡于,蒸餾水,中充分溶脹后,配成,凝膠懸浮液,3,凝膠色譜柱的裝填方法,固定：將色譜柱處置固定在支架上,裝填,將,凝膠懸浮液,一次性的緩慢倒入,內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動色譜柱，使凝,色譜柱,膠填裝均勻,注意：凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠,顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時(shí)不能有氣,泡存在：因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì),的洗脫次序，降低分離效果,洗滌平衡,50cm,裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在,高的,操作壓下，用,300ml,的,20mmol/l,

13、的磷酸緩沖液,pH,為,7.0,充分,洗滌平衡,12,小時(shí),注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有,氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終,生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗,脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重,新填裝,3,樣品加入與洗脫,加樣前,打開下端出口，使柱內(nèi)凝,膠面上的,緩沖液,緩,慢下降到與,凝膠面,平齊，關(guān)閉出口,加透析樣品,調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊,滴加透析樣品：用,吸管,將,1ml,透析液,的樣品加到色譜柱的,頂端,樣品滲入凝膠床：,樣品完全進(jìn)凝膠層,洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫,收集：待,紅色的蛋白質(zhì),接近色譜柱底,端時(shí)，用試管收集流出液，每,5ml,收集一試管連續(xù)收

14、集,注意正確的加樣操作,不要觸及破壞凝膠面,貼壁加樣,使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動,思考,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜,分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí),候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分,離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作,思考,血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定,首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離,心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處,理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即,樣品的粗分離,；然后通過凝膠色譜法,將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品,的,純化,；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn),行,純度鑒定,3.SDS,聚丙烯酰胺凝膠電泳,判斷

15、,純化,的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求,需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定,3.SDS,聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅,蛋白純度,1,試劑的配制,丙烯酰胺和,N, N,甲叉雙丙烯酰胺,用去離子,水配制,29,29 g/100 mL,下同）的丙烯酰,胺和,1,的,N, N,甲叉雙丙烯酰胺的貯存液,十二烷基硫酸鈉,SDS,用去離子水配成,10,的貯存液，于室溫保存,用于制備分離膠和濃縮膠的,Tris,緩沖液,TEMED,作用通過催化過硫酸銨形成自由,基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合,用去離子水配制,10,過硫酸銨：作用提供,驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自,由基。此溶液須配制新鮮液,Tris,甘氨酸電泳緩沖液,25

16、mmol/L Tris,250 mmol/L,甘氨酸,pH 8.3,0.1,的,SDS,樣品處理液,50 mmol/L Tris,HCl(pH,6.8,100 mmol/L DTT,巰基蘇糖醇,或用,5,的巰基乙醇,2,的,SDS,0.1,的溴酚藍(lán),10,的甘油,染色液,0.1,的考馬斯亮藍(lán),R250,40,的甲,醇,10,的冰醋酸,脫色液,10,的甲醇和,10,的冰醋酸,由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有,很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因,此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行,TEMED,和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛,皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因,此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一

17、定按照實(shí)驗(yàn)要求和步,驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套,2,電泳方法步驟,1,根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板,2,SDS,聚丙烯酰胺凝膠制備,SDS,聚丙烯酰胺分離膠制備,用去離子水,4.6 mL,30,的丙烯酰胺,2.7 mL,1.5mol,pH 8.8,的,Tris,緩沖液,2.5 mL,10,的,SDS 0.1 mL,10,的過硫酸胺,0.1 mL,TEMED,0.006mL,混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的,間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間,梳子,的齒長再加,0.5 cm,再在膠液面上小心注入,一層水（約高,2,3 mm,，以阻止氧氣進(jìn)入凝,膠溶液,分離膠聚合完全后（約,30 min,，

18、傾出覆蓋,水層，再用濾紙吸凈殘留水,配制,SDS,聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液,用去離子水,2.7 mL,30,的丙烯酰胺,0.67 mL,1.0 mol,pH 6.8,的,Tris,緩沖液,0.5 mL,10,的,SDS0.041 mL,10,的過硫酸胺,0.04 mL,TEMED 0.004 mL,混合均勻，直接灌注在聚,合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干,凈的梳子。整個操作過程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn),生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之,間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合,3,樣品處理,在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液,在100 溫度下加熱,3 min,以使蛋白質(zhì)變性,4,

19、濃縮膠聚合完全后,30 min,，小心移出梳,子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入,Tris,甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底,部兩玻璃板之間的氣泡,5,加樣,按順序加樣，加樣量通常為,10,25 L。樣,品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后,即進(jìn)行凝膠色譜分離之前,的樣品和凝膠色譜分,離之后的樣品,6,電泳,將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為,8,V/cm,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高,到,15 V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠,底部上方約,1 cm,處，關(guān)閉電源,7,剝膠,從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻,璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下,部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位,8,染色,將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染,色,1-2 h,9,脫色,染色完