微生物標(biāo)本接種

1、微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集與接種,內(nèi)容,血培養(yǎng) 尿培養(yǎng) 痰培養(yǎng) 膿液 腦脊液 前列腺 STD 厭氧培養(yǎng),血培養(yǎng),增菌培養(yǎng) 商品血培養(yǎng)瓶 成人瓶、兒童瓶、中和抗生素瓶 無(wú)菌操作采集血標(biāo)本接種到培養(yǎng)瓶后，輕輕混勻以防血液凝固。立即送檢，切勿冷藏。 采血量成人采血量是1020ml，兒童15ml。血液和肉湯之比為1:51:10。 35 培養(yǎng)5-7天,體積 % 陽(yáng)性血培養(yǎng)結(jié)果 vs. 采集的套數(shù),%,99%,89%,80%,真陽(yáng)性,20 ml/套,Mayo Clinic Study,用于培養(yǎng)的血液體積,采集血培養(yǎng)時(shí)間的重要性,9% +,14% +,9% +,11% +,發(fā)熱高峰前12-2.5小時(shí),發(fā)熱高峰前2.

2、5-0.5小時(shí),發(fā)熱高峰期間,發(fā)熱高峰后1-12小時(shí),166 病人,105 病人,199 病人,258 病人,Thomson et al. 1991. ASCP. Mayo Clinic Study,立即獲得足夠血液并且開始抗生素治療,從不同部位獲得2-3套血培養(yǎng)(40-60ml血液) 最好在5分鐘內(nèi)采集,#1,#2,確定檢測(cè)陽(yáng)性的培養(yǎng)時(shí)間,陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間,隨著時(shí)間推移敗血癥病原菌的變遷,% 住院患者血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果,#1 pathogen,From UW, Madison and G.Washington Univ., St. Louis,血培養(yǎng)存在的主要問(wèn)題,如果皮膚定植的細(xì)菌沒(méi)有被殺死，這些

3、細(xì)菌將通過(guò)針頭被吸入血培養(yǎng)瓶并在瓶中生長(zhǎng) 這些細(xì)菌(主要為凝固酶陰性葡萄球菌) 引起導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥 (住院患者血培養(yǎng)第一位) 醫(yī)生不能將真的凝固酶葡萄球菌感染和皮膚定植菌“污染”相區(qū)分，因此他們用萬(wàn)古霉素治療患者,皮膚凝固酶陰性葡萄球菌定植于輸液管,皮膚不是無(wú)菌的; 定植細(xì)菌“污染”血培養(yǎng),葡萄球菌在塑料CVC表面生長(zhǎng)形成生物膜,污染細(xì)菌,血培養(yǎng)污染定義為在幾次血培養(yǎng)中單個(gè)血培養(yǎng)下列細(xì)菌陽(yáng)性: 凝固酶陰性葡萄球菌 棒狀桿菌 微球菌 丙酸桿菌 芽孢桿菌,血培養(yǎng)污染 vs. 皮膚消毒,% 污染,Studies from Baylor, Nashville, CPSID2（生物梅里埃公司）; Ur

4、iSelect （Biorad公司）; Rambach; others,蛋白胨，酵母提取物，色原物,科瑪嘉顯色培養(yǎng)基（BBL）,大腸埃希菌,腸球菌,無(wú)乳鏈球菌,腐生葡萄球菌,同樣的接種物在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基（BBL）上生長(zhǎng),大腸埃希菌，腸球菌和變形桿菌在血平皿上生長(zhǎng),CHROMagar Orientation (BBL),chromID CPS- 生物梅里埃公司的產(chǎn)品快速鑒定大腸埃希菌，變形桿菌和腸球菌,可分離所有尿道病原菌 更好的可操作性 更好的鑒定能力 更高的可靠性,尿培養(yǎng),【操作步驟】 1培養(yǎng)皿放置至室溫，先充分搖勻尿液 2用1l定量接種環(huán)或用微量移液器無(wú)菌吸取10ul尿液接種于羊血平皿和

5、MAC上，然后用無(wú)菌接種環(huán)劃線涂布，置35，最好在510co2環(huán)境下，孵育1824小時(shí) 3次日觀察結(jié)果，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，陽(yáng)性結(jié)果做細(xì)菌鑒定和藥敏。,尿培養(yǎng),【定量標(biāo)準(zhǔn)】 用1l接種環(huán)，結(jié)果1000cfu/ml；用10l接種環(huán)，結(jié)果100cfu/ml。 菌計(jì)10萬(wàn)cfu/ml，繼續(xù)鑒定和藥敏。 降低標(biāo)準(zhǔn)的情況： 幼兒、兒童或男性的確定的尿路感染，其尿標(biāo)本定量也可10萬(wàn)cfu/ml； 插導(dǎo)管的患者、最近用過(guò)抗生素者、大量喝水者、伴發(fā)膿尿和有癥狀者、有尿路阻塞 或由于血源性傳播而患有腎盂腎炎者，其尿標(biāo)本定量也可10萬(wàn)cfu/ml； 患有尿道綜合征的性活躍的年輕女性，其尿標(biāo)本定量也可100cfu

6、/ml。,評(píng)價(jià)尿培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn),尿培養(yǎng)-注意事項(xiàng),標(biāo)本留取嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。 不要將尿液標(biāo)本接種于增菌肉湯培養(yǎng)基中。 清潔中段尿標(biāo)本不要進(jìn)行離心處理。 尿液標(biāo)本原則上不做厭氧培養(yǎng)。 尿液收集后應(yīng)立即送檢 ，不能送檢者可置48冰箱儲(chǔ)藏，儲(chǔ)存時(shí)間24小時(shí)。 患者應(yīng)在用藥前或停用抗生素后至少三天留取尿液，尿液中勿加防腐劑。,痰培養(yǎng)-操作步驟,取適量痰液化劑放入痰標(biāo)本盒內(nèi)混勻放置30分鐘， 用無(wú)菌環(huán)挑23環(huán)標(biāo)本，分區(qū)劃線接種于羊血平皿或沙保培養(yǎng)基上、Mac置35孵育1824小時(shí),巧克力平板5co2 35孵育1824小時(shí)。 觀察結(jié)果，根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行鑒定及藥敏。 挑取膿液部分涂片，革蘭染色鏡檢。判斷標(biāo)本

7、是否合格。,痰培養(yǎng)-操作步驟,痰標(biāo)本涂片染色顯微鏡檢查的分類：判斷標(biāo)準(zhǔn) 比較簡(jiǎn)單的方法就是確定鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞數(shù) 10/低倍視野，說(shuō)明混有痰液。 細(xì)胞數(shù)/低倍視野 WBC 10 鱗狀上皮細(xì)胞25 不合格 WBC 1025 鱗狀上皮細(xì)胞 25 不合格 WBC 25 鱗狀上皮細(xì)胞 25 不合格 WBC 25 鱗狀上皮細(xì)胞1025 可接受 WBC 25 鱗狀上皮細(xì)胞10 合格 WBC 25 鱗狀上皮細(xì)胞25 可接受?,用革蘭氏染色來(lái)評(píng)估呼吸道標(biāo)本是否合格,10鱗狀上皮細(xì)胞/LPF拒收！,彈性纖維，中性粒細(xì)胞多，鱗狀上皮細(xì)胞少，有代表性的好標(biāo)本,形態(tài)學(xué)鑒別要訣球菌,革蘭陰性雙球菌腎型豆子樣，平行

8、縱軸排列=奈瑟菌屬,實(shí)際革蘭氏染色,革蘭陰性雙球菌：在生殖道標(biāo)本或腦脊液中多為奈瑟菌屬；在下呼吸道分泌物中提示為卡他莫拉菌,形態(tài)學(xué)鑒別要訣球菌,革蘭陽(yáng)性球菌成對(duì)，成鏈較小、拉長(zhǎng)的、從不4聯(lián)排列=鏈球菌屬,革蘭陽(yáng)性球菌呈堆排列，通常很圓，細(xì)胞較大，不拉長(zhǎng)，可成對(duì)，但鏈不超過(guò)4個(gè)細(xì)胞?？赡芤蛎撋^(guò)度呈革蘭陰性。但如果不是腎型話不可能為革蘭陰性菌。,鏈狀的革蘭陽(yáng)性球菌：提示鏈球菌 短鏈，6個(gè)細(xì)胞，提示腸球菌或B群鏈球菌；肺炎鏈球菌,血培養(yǎng)中長(zhǎng)鏈的革蘭陽(yáng)性球菌（6個(gè)細(xì)胞）提示化膿鏈球菌或草綠色鏈球菌,革蘭氏陽(yáng)性球菌,更多的革蘭氏染色形態(tài)學(xué),呈堆或四聯(lián)排列的革蘭陽(yáng)性球菌提示葡萄球菌,革蘭陽(yáng)性桿菌的形態(tài)學(xué)

9、鑒別要訣,革蘭氏陽(yáng)性桿菌可以很規(guī)則，如果是需氧菌則非?？赡苁茄堪麠U菌屬，如果是厭氧則非常可能是梭菌屬。如果很小，可能是不呈鏈狀的李斯特菌屬，如果呈鏈狀則很可能是乳酸桿菌屬。,革蘭陽(yáng)性不規(guī)則的桿菌（多形態(tài)），一端比另一端粗。常相互吸附或呈籬笆樣排列=棒狀桿菌屬或丙酸桿菌屬,細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,革蘭陰性雙球菌,多形態(tài)提示混合厭氧菌感染,外型奇特的酵母菌，不像米老鼠的耳朵或白色念珠菌橢圓形孢子。報(bào)告“真菌成分和酵母樣細(xì)胞”。不要遺忘革蘭陰性桿菌。,痰培養(yǎng)-特別提醒,洋蔥伯克霍爾德菌 是一種重要的呼吸道致病原，可引起囊性纖維化。常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。 諾卡菌（Nocardia spp） 諾卡菌是一種重要的呼吸

10、道致病菌。培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，如果延遲時(shí)間不長(zhǎng)，4保存也可以接受。標(biāo)本革蘭染色檢查，可以發(fā)現(xiàn)小的革蘭陽(yáng)性菌，外觀呈分枝狀、絲狀或球狀。沒(méi)有特異的培養(yǎng)諾卡菌的培養(yǎng)基，可用心浸液沙氏葡萄糖瓊脂、腦心浸液瓊脂、羊血瓊脂或胰蛋白大豆瓊脂。25-37孵育3周，37更好。 鼻咽部金黃色葡萄球菌 確定金黃色葡萄球菌帶菌者，用聚酯頭拭子從前鼻孔取鼻咽分泌物，接種5羊血，35孵育2d。,痰培養(yǎng)-特別提醒,鼻咽部腦膜炎奈瑟菌 采集鼻咽拭子標(biāo)本，接種血瓊脂、巧克力瓊脂或MTM培養(yǎng)基，5CO2的潮濕環(huán)境，35孵育72h。 喉A群鏈球菌 喉部標(biāo)本最常用于診斷A群鏈球菌喉炎，標(biāo)本接種血瓊脂510CO2環(huán)境，3

11、5孵育48h。,腦脊液-操作步驟,將腦脊液標(biāo)本經(jīng)離心（1500g，15min）后，將上清液倒入消毒的試管，留下0.5ml沉淀和液體，充分混勻。 無(wú)菌吸取標(biāo)本2030ul分別劃線接種于羊血平皿、巧克力平皿，分別置燭缸和普通培養(yǎng)箱內(nèi)35孵育2448小時(shí)。 應(yīng)同時(shí)制備涂片，革蘭染色鏡檢。 觀察結(jié)果，有細(xì)菌生長(zhǎng)者進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏。,腦脊液-操作步驟,也可將腦脊液標(biāo)本注入增菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)先行增菌培養(yǎng)，具體操作參見血液培養(yǎng)。 采集CSF是為了診斷腦膜炎，細(xì)菌性腦膜炎分為急性和慢性兩種。急性腦膜炎在感染后24h內(nèi)產(chǎn)生癥狀，通常由化膿性細(xì)菌引起，最可能的病原菌根據(jù)患者年齡和疾病是否由社區(qū)或醫(yī)院感染而有變化。包括

12、：B群鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等。慢性腦膜炎（癥狀持續(xù)至少4周）的典型致病菌包括：結(jié)核分枝桿菌、梅毒螺旋體、布魯氏菌、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體和博氏疏螺旋體。 腦脊液離心涂片抗酸染色，應(yīng)用30003600g 30min。 厭氧菌很少引起腦膜炎，因此不需要對(duì)腦脊液常規(guī)進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)。厭氧菌常與腦膿腫形成、硬腦膜下積膿和硬腦膜外膿腫有關(guān)。,膿液培養(yǎng)-標(biāo)本要求,臨床醫(yī)生根據(jù)需要無(wú)菌操作取材，比較理想的方法是用注射器抽取膿性物質(zhì)。從膿腫底部或膿腫壁的取樣，效果最好。如果不能獲得抽取物，也可以用拭子從傷口深處采集滲出物，至少采集兩個(gè)拭子，一個(gè)用于涂片染色，一個(gè)用于培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)最

13、好不用拭子。 將采集的標(biāo)本置于無(wú)菌試管內(nèi)，立即送檢。 厭氧培養(yǎng)標(biāo)本取材應(yīng)迅速、準(zhǔn)確，禁止接觸空氣，盛標(biāo)本容器內(nèi)要排盡空氣,膿液培養(yǎng),【標(biāo)本處理】 標(biāo)本劃線接種于羊血平皿，35孵育2448小時(shí)。同時(shí)涂片革蘭染色。 厭氧培養(yǎng)接種布氏血瓊脂，厭氧環(huán)境培養(yǎng)。 觀察結(jié)果，有細(xì)菌生長(zhǎng)者進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏。,前列腺培養(yǎng),【標(biāo)本要求】 首先用無(wú)菌等滲鹽水的拭子洗凈尿道口。 由臨床醫(yī)生行前列腺按摩術(shù)留取標(biāo)本于無(wú)菌試管內(nèi)，立即送檢。 【標(biāo)本處理】 將標(biāo)本劃線接種于羊血平皿，35孵育2448小時(shí)。 觀察結(jié)果，有細(xì)菌生長(zhǎng)者進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏。 【注意事項(xiàng)】 留取標(biāo)本注意避免污染。 疑為性傳播疾病做相應(yīng)的STD培養(yǎng)。,

14、淋球菌培養(yǎng),【操作步驟】 待檢物劃線接種于專用MTM平皿上，將接種好的平皿置燭虹中置35溫箱孵育48小時(shí)； 取出平皿，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定； 鑒定： 涂片革蘭染色； 氧化酶試驗(yàn)；內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)；生長(zhǎng)試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)。,支原體培養(yǎng),從410 冰箱中取出所需數(shù)量地培養(yǎng)基瓶，恢復(fù)液及鑒別、定量、藥敏板，使其在接種前接近室溫。 旋下外蓋，取下丁基橡膠內(nèi)塞，然后擠滴加入恢復(fù)液，培養(yǎng)基迅速融解、表面至標(biāo)簽上緣處（約1.8ml） 應(yīng)隨即、直接往培養(yǎng)基瓶接種標(biāo)本（如果延遲接種，則標(biāo)本置室溫不超過(guò)2小時(shí)；在410 時(shí)不超過(guò)8小時(shí)） 混勻后，從瓶?jī)?nèi)分別取50微升（1大滴）加到鑒別、定量、藥敏板的每一小孔中 然后，在

15、每孔正中上方，準(zhǔn)確、擠滴加入一滴石蠟油。 將鑒別、定量、藥敏板置36 孵育箱中培養(yǎng)12小時(shí)后，即可開始觀察結(jié)果;不見陽(yáng)性者，則連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至48小時(shí)結(jié)束。,臨床細(xì)菌室厭氧菌培養(yǎng)基本程序,厭氧培養(yǎng)基本設(shè)備 厭氧標(biāo)本采集和運(yùn)送步驟 厭氧菌的分離和鑒定步驟 厭氧菌的報(bào)告 厭氧菌的藥敏試驗(yàn) 厭氧菌的菌種保存,厭氧培養(yǎng)基本設(shè)備,輸送瓊脂 Amies瓊脂 (41998、41999) 難辯梭菌瓊脂(43213) 厭氧培養(yǎng)基 厭氧培養(yǎng)裝置 厭氧氣袋 厭氧盒或厭氧罐 厭氧培養(yǎng)箱 厭氧菌鑒定方法,需要準(zhǔn)備的厭氧菌培養(yǎng)基,斯氏瓊脂+5%羊血：適用所有厭氧菌生長(zhǎng) 斯氏萬(wàn)古霉素+5%羊血：適用革蘭陰性厭氧菌 難辯

16、梭菌選擇培養(yǎng)基(CCFA)：分離難辯梭菌 改良厭氧血平皿,改良厭氧血平皿配制,血瓊脂基礎(chǔ) (按1000ml量） 半胱氨酸： 0.4克 氯化血紅素(5mg/ml): 1ml 1%維生素K1: 0.1ml 加熱溶解冷卻后調(diào)整pH7.4 高壓滅菌后冷卻至50時(shí)加入5-10%的脫釬維羊血 混合后傾注平皿。 營(yíng)養(yǎng)好可供大多數(shù)厭氧菌生長(zhǎng) 質(zhì)量控制：產(chǎn)黑色素普雷沃菌形成典型菌落和色素 產(chǎn)氣夾膜梭菌有雙圈溶血。,厭氧標(biāo)本的選擇、采集和運(yùn)送,可疑厭氧菌感染特征 感染局部產(chǎn)生氣體 分泌物有惡臭 分泌物帶血或呈黑色 粘膜周圍的感染 如肛周、口腔、鼻竇、咽頰等 細(xì)菌培養(yǎng)陰性，但有菌血癥表現(xiàn) 長(zhǎng)期使用氨基糖苷類抗生素，

17、但無(wú)效者 有基礎(chǔ)疾病免疫低下者,需做厭氧血培養(yǎng)的高危人群,腸膿毒癥、女性生殖道感染、褥瘡及呼吸道感染患者 ICU患者或近期做過(guò)腹部外科手術(shù)的患者 嚴(yán)重?zé)齻屯鈧颊?伴有嚴(yán)重心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、移植和免疫抑制患者 老年患者 臨床高度懷疑有厭氧菌感染的患者,絕大多數(shù)住院患者需要做厭氧血培養(yǎng),正確地收集標(biāo)本,不能做厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本： 咽、鼻、尿道或直腸拭子。 咳出的痰，通過(guò)支氣管鏡取的分泌物 排出或?qū)С龅哪蚣拔竷?nèi)容物。 糞便（除難辨梭菌）,可做厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本,從未開放的膿腫抽取膿液 尿：從恥骨聯(lián)合上方做膀胱穿刺吸出 從腎造口管收集的 氣管切開吸取的肺分泌物 女性生殖器：后穹隆穿刺 穿刺抽出

18、的胸腔液、腹腔液、腦脊液 竇道標(biāo)本： 可插入小導(dǎo)管用注射器吸出竇道損傷部位取材做活組織檢查,床邊采集標(biāo)本的步驟,除去表面陳舊的膿和分泌物,從深處采取 首先接種在厭氧培養(yǎng)基,立即置厭氧容器內(nèi) 同時(shí)撕開并放入產(chǎn)氣袋,放指示劑 立即蓋好蓋或封好厭氧袋口 剩余部分標(biāo)本種需氧培養(yǎng)基 剩余最后標(biāo)本作兩張涂片 到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，35度孵箱培養(yǎng),無(wú)菌體液,直接種入?yún)捬跹囵B(yǎng)瓶 同時(shí)種普通血培養(yǎng)瓶,厭氧菌分離的基本分離步驟,第一次耐氧試驗(yàn): 初始標(biāo)本需氧和厭氧對(duì)照 發(fā)現(xiàn)可疑菌落(需氧環(huán)境不生長(zhǎng)菌落) 第二次耐氧試驗(yàn): 多個(gè)可疑菌落分別接種需氧和厭氧平皿, 分別置35度作需氧和厭氧培養(yǎng). 第三次耐氧試驗(yàn): 取僅厭氧環(huán)境生長(zhǎng)菌落進(jìn)行厭氧和需氧培養(yǎng) 如分離的菌落僅在厭氧環(huán)境生長(zhǎng),可確定為厭氧菌.,重要的提示,做耐氧試驗(yàn)時(shí)，原始平板不要丟棄，繼續(xù)厭氧培養(yǎng) 某些厭氧菌生長(zhǎng)緩慢 一旦厭氧試驗(yàn)失?。ú僮髡`差等），有備份菌株,厭氧菌的鑒定,I級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)： 根據(jù)耐氧試驗(yàn)結(jié)果，革蘭染色，菌落特點(diǎn) 提供厭氧菌初步推斷報(bào)告。 II級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)： 根據(jù)革蘭染色反應(yīng)，鏡下形態(tài)，菌落形態(tài)，耐氧試驗(yàn) 用自制或國(guó)產(chǎn)傳統(tǒng)生化反應(yīng)試劑定種 III級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)： 能采用國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)化鑒定系統(tǒng) 如API-20A、Micro ID、Vitek-ANI 氣-液相色譜儀,厭氧菌的藥敏試驗(yàn),厭氧菌感染以經(jīng)驗(yàn)用藥為