微生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)-土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,實(shí)驗(yàn)流程,土壤樣品中微生物的 分離純化,霉菌,土壤中微生物的分離、純化和培養(yǎng),相關(guān)理論知識(shí)（1）,微生物的分離與純化 從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程。 常用的分離、純化方法 微生物能在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)成菌落，通常一個(gè)菌株可以長(zhǎng)成一個(gè)菌落。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種微生物。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,相關(guān)理論知識(shí)（2）,土壤中的微生物 土壤是微生物生長(zhǎng)繁殖的天然培養(yǎng)基 ，是人類最豐富的“菌種資源庫(kù)”。 不同類型的土壤、同一類型土壤的不同深度或不同水

2、平位置，微生物種類和數(shù)量變化很大。 由于表層土壤比較干燥，且接受大量紫外線照射，所以微生物主要分布在營(yíng)養(yǎng)條件良好、氧氣含量比較豐富的淺土層,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,每克耕作層土壤含菌量十倍遞減 細(xì)菌（108） 放線菌（107，孢子） 霉菌（106，孢子） 酵母菌（105） 藻類（104） 原生動(dòng)物（103）,乳酸乳球菌 乳酸乳球菌是一類能在碳水化合物中，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，它在酸奶中大量存在。,目的要求,1、了解微生物分離和純化的原理 。 2、掌握常用的分離純化微生物的方法。 3、掌握倒平板的方法。 4、進(jìn)一步熟練和掌握微生物的無(wú)菌操作技術(shù)。 5、掌握微生物的培養(yǎng)方法。,土

3、壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,實(shí)驗(yàn)原理,微生物分離與純化 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程。 平板分離法 普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件（如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等,或加入某種抑制劑），在平板上培養(yǎng)微生物，當(dāng)平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取，得到純種的微生物,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,試劑與器材,1、材料 含大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、黑曲霉、根霉、青霉和放線菌的土壤樣品，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（斜面、液體、半固體）、馬丁氏培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等 2、試劑 10%酚、4%水瓊脂 3、器材 盛9mL無(wú)菌水的試管、盛

4、90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、涂布器、無(wú)菌吸管、接種環(huán)，酒精燈、無(wú)菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 用水定容至 1000ml pH 7.0-7.2 用于分離細(xì)菌,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,高氏一號(hào)培養(yǎng)基,可溶淀粉 20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 瓊脂 15-20g pH 7.2-7.4 用水定容至 1000ml 用于分離放線菌,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,查

5、氏培養(yǎng)基,NaNO3 2g K2HPO4 1g KCl 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 蔗糖 30g 瓊脂 15-20g 用水定容至 1000ml 用于分離霉菌,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,馬丁氏培養(yǎng)基,葡萄糖 10g 蛋白胨 5g K2HPO4 1g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 瓊脂 15-20g pH 自然 用水定容至 800ml 用于分離酵母菌,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,CM固體培養(yǎng)基,蔗糖 10g 蛋白胨 10g 酵母浸膏 10g K2HPO4 10g NaCl 2g MgSO4 0.2g 瓊脂 15-20g 自然pH

6、 定容至1000ml,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,實(shí)驗(yàn)步驟,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,注意事項(xiàng),1、接種環(huán)要灼燒滅菌。接觸菌體前要冷卻。 接種后要在火焰上灼燒。 2、實(shí)驗(yàn)在潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作時(shí)菌體不 應(yīng)和火焰太過(guò)接近。 3、本實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)格地按照無(wú)菌操作進(jìn)行。 4、培養(yǎng)時(shí)要倒置培養(yǎng)，防止染菌。 5、取單菌落時(shí)不要碰到其它的菌落。,土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,相關(guān)理論知識(shí),細(xì)菌形態(tài) 群體的形態(tài) 細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動(dòng)性

7、直接相關(guān)。,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,個(gè)體的形態(tài) 主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。 細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色三種類型。,普通光學(xué)顯微鏡,目的要求,1、顯微鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)。 2、初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)。 3、了解簡(jiǎn)單染色法的原理，并掌握其操作方法 4、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無(wú)菌 操作技術(shù)。 5、鞏固顯微鏡的油鏡的使用方法。,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,簡(jiǎn)單染色法原理,簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料使細(xì)菌著色以顯

8、示其形態(tài)的染色方法。常用于染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。 堿性染料電離時(shí)，其分子染色部分帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。由于細(xì)菌生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,試劑與器材,1、材料 枯草芽孢桿菌、大腸桿菌 2、試劑 呂氏堿性美藍(lán)染液或草酸銨結(jié)晶紫染液 3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、雙層瓶（內(nèi) 裝香柏油及二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水

9、等。,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,實(shí)驗(yàn)步驟,涂片 干燥：室溫自然干燥 固定：通過(guò)火焰23次，細(xì)胞質(zhì)凝固 染色：滴加染液 沖洗：水洗至無(wú)色 干燥：自然，吹干，吸干 鏡檢,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,注意事項(xiàng),涂片時(shí)水滴不要太大，菌體最好涂成一個(gè)薄膜。要求涂布均勻。 室溫自然干燥。 固定時(shí), 通過(guò)火焰23次，不可以加熱過(guò)久。 染色時(shí), 滴加染液覆蓋上菌體薄膜即可。 沖洗時(shí), 水洗至無(wú)色，要注意水流要有一個(gè)角度，從載片的一端自然流到另一端，但是水流要通過(guò)染色過(guò)的菌體薄膜。水流不宜過(guò)大，防止將菌體沖走。 鏡檢時(shí)，油鏡與普通的物鏡要嚴(yán)格地按照操作規(guī)程執(zhí)行。,細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,細(xì)菌的革蘭氏染色,相關(guān)理論知識(shí),革蘭氏染色

10、法(Gramstaining) 由丹麥醫(yī)生GhristianGram于1884年創(chuàng)立。 通過(guò)革蘭氏染色法可將所有細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性兩大類。它是鑒別細(xì)菌的重要方法。,細(xì)菌的革蘭氏染色,目的要求,1、初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法 步驟 。 2、掌握革蘭氏染色法的原理。,細(xì)菌的革蘭氏染色,革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)原理,革蘭氏染色能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染

11、后變成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。,細(xì)菌的革蘭氏染色,試劑與器材,1、材料 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。 2、試劑 結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅等。 3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、雙層瓶（內(nèi) 裝香柏油及二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水等。,細(xì)菌的革蘭氏染色,初染,復(fù)染,脫色,媒染,結(jié)晶紫,碘液,95%乙醇,番紅,甲菌,乙菌,Procedures of Gram Staining,G+,G-,顯微鏡下菌體呈紅色者為革蘭氏染色陰性細(xì)菌(常以G-表示)，呈深藍(lán)紫色者為革蘭氏染色陽(yáng)性反應(yīng)

12、細(xì)菌(常以G+表示)。,革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)步驟,制片：取菌種培養(yǎng)液常規(guī)涂片，干燥，固定。 初染：滴加結(jié)晶紫，染色12min，水洗； 媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min, 水洗； 乙醇脫色：濾紙吸去殘水，傾斜玻片用95乙醇 洗滌脫色至無(wú)色，立即水洗； 復(fù)染：番紅液復(fù)染約2min，水洗； 鏡檢：革蘭氏陽(yáng)性菌（藍(lán)紫色）；革蘭氏陰性菌 （紅色）,細(xì)菌的革蘭氏染色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,革蘭氏陰性菌,革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)菌的革蘭氏染色,革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察,細(xì)菌的革蘭氏染色,細(xì)菌的革蘭氏染色,注意事項(xiàng),1. 涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚。 2在染色過(guò)程中，不可使染液干涸。 火焰固定不 宜過(guò)熱。 3脫色時(shí)間十分重要

13、，過(guò)長(zhǎng)，則脫色過(guò)度，會(huì)使陽(yáng) 性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被 染成陽(yáng)性菌。 4不能選用老齡菌。,細(xì)菌的革蘭氏染色,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),相關(guān)理論知識(shí)（1）,微生物分類學(xué)（microbialtaonomy） 它是一門按微生物的等級(jí)關(guān)系把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群（taxon）的科學(xué)。它具體的任務(wù)是分類（classificontion）、鑒定（indentification）和命名（namendature ）。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),相關(guān)理論知識(shí)（2）,微生物的鑒定 獲得該微生物的純種培養(yǎng)物（pureculture）； 測(cè)定一系列必要的鑒定指標(biāo)； 查找權(quán)威性的鑒定手冊(cè)。

14、 經(jīng)典分類鑒定方法 形態(tài)；生理、生化反應(yīng)；生態(tài)特性；生活史特點(diǎn)；血清學(xué)反應(yīng)（免疫學(xué)鑒定）；噬菌體的敏感性等 現(xiàn)代分類鑒定方法 微生物遺傳型的鑒定 細(xì)胞化學(xué)成分的鑒定,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),目的要求,1、不同微生物對(duì)各種有機(jī)分子水解能力不同，說(shuō)明 不同微生物有不同的酶系統(tǒng)。 2、掌握微生物大分子水解實(shí)驗(yàn)的原理及方法。 3、了解糖發(fā)酵原理及在腸道細(xì)菌鑒定中的作用。 4、了解并掌握細(xì)菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn) 原理和方法。 5、了解細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物 在鑒別細(xì)菌中的意義。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),實(shí)驗(yàn)原理（1）,各種細(xì)菌在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同的細(xì)菌分解大分子碳水化

15、合物、蛋白質(zhì)和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產(chǎn)物也不一樣。不同細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同也說(shuō)明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們有不同的酶系統(tǒng)。 微生物對(duì)大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過(guò)將大分子物質(zhì)降解為小分子化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),多糖的水解,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),實(shí)驗(yàn)原理（2）,細(xì)菌代謝過(guò)程中產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸）和/或產(chǎn)氣(H2,CH4,CO2）；產(chǎn)酸用指

16、示劑檢測(cè)；產(chǎn)氣通過(guò)直接觀察。 有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身沒(méi)有顏色，不能直接看見(jiàn)，但當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),吲哚實(shí)驗(yàn)- 1,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),吲哚實(shí)驗(yàn)- 2,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),VP（+）反應(yīng),細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),實(shí)驗(yàn)原理（3）,不同細(xì)菌利用檸檬酸鹽能力不同，有的細(xì)菌可利用檸檬酸鹽作為碳

17、源，有的則不能。某些細(xì)菌將檸檬酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而形成碳酸鈉，使培養(yǎng)基堿性增加。根據(jù)培養(yǎng)基中指示劑變色來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。指示劑可用溴麝香草酚藍(lán)( pH6 呈黃色， pH 6-7.6呈綠色，pH7.6呈藍(lán)色）。 有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，可產(chǎn)生黑色硫化鉛或硫化鐵沉淀，從而可確定硫化氫的產(chǎn)生。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),試劑與器材,1、材料 乳酸乳球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、固體淀粉培養(yǎng)基。 2、試劑 甲基紅試劑、40%氫氧化鉀、5%-萘酚、乙 醚、吲哚試劑。 3、器材 德漢氏小

18、管、試管、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓 滅菌器等。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),淀粉的水解實(shí)驗(yàn),1、固體淀粉培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50,倒平板； 2、用記號(hào)筆將平板分區(qū)，不同的區(qū)域接種不同的菌種，記錄接種的菌種名； 3、平板倒置在37培養(yǎng)24h; 4、將平板打開，加入Lugols碘液，輕旋轉(zhuǎn)，觀察結(jié)果。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)步驟 取半固體葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管支，分別用接種針穿刺接入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和陰性對(duì)照，37 培養(yǎng)24h。 觀察記錄 與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該菌能分解

19、該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”表示。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),吲哚實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)步驟 用接種環(huán)分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌到含有蛋白胨水培養(yǎng)基的2支試管中,將試管置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。向培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加3-4滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置3min,待乙醚上升后，沿試管壁緩慢加入2滴吲哚試劑。 觀察記錄 在乙醚與培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物的，為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),V-P test（乙酰甲基甲醇試驗(yàn)）,以無(wú)菌操作分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別接種于2支葡萄糖蛋

20、白胨水培養(yǎng)基（V-P test），空白對(duì)照管不接菌，置37恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2d后，將培養(yǎng)物內(nèi)加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5% -奈酚溶液，用力振蕩，再放入37 保溫15-30 min, 若培養(yǎng)物呈紅色，為V-P test 陽(yáng)性。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn),將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別接種于2支檸檬酸鹽斜面上，置于37培養(yǎng)24-48小時(shí)。 觀察檸檬酸鹽培養(yǎng)基上有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)和是否變色，斜面呈藍(lán)色的是陽(yáng)性反應(yīng)，呈綠色的為陰性反應(yīng)。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn),將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別穿刺接種于2支半固體培養(yǎng)基中，置于37培養(yǎng)24-48小時(shí)。 觀察結(jié)果，

21、如培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀線者，為陽(yáng)性反應(yīng)。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),注意事項(xiàng),1、實(shí)驗(yàn)中無(wú)菌操作。 2、吲哚實(shí)驗(yàn)中加入乙醚時(shí)要緩慢地加入。 3、培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到要求時(shí)間，現(xiàn)象明顯。 4、配制氫氧化鉀時(shí)，要注意不要腐蝕皮膚和實(shí)驗(yàn)臺(tái)。,細(xì)菌細(xì)胞的生理生化反應(yīng),酵母菌的形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,相關(guān)理論知識(shí)（1）,酵母菌形態(tài) 酵母菌是單細(xì)胞真核微生物。酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等。比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大得多。酵母菌無(wú)鞭毛，不能游動(dòng)。 酵母菌具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu),有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體等，有的還具有微體。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直

22、接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,酵母細(xì)胞一般呈卵圓形、圓形或圓柱形。細(xì)胞寬約1-5um，長(zhǎng)約4-30um，且常形成假菌絲。沒(méi)有鞭毛。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,相關(guān)理論知識(shí)（2）,酵母菌菌落特征 大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色。,啤酒酵母的菌落,紅酵母的菌落,各種酵母菌的菌落,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,顯微計(jì)數(shù)法,顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的懸浮液。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌

23、則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,血球計(jì)數(shù)板,血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片 上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中 間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一 個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)分 為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格； 另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方 格又分成16個(gè)小方格。不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu) 造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小 方

24、格組成。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,血球計(jì)數(shù)板特征,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,目的要求,1、觀察酵母菌的形態(tài)特征及出芽方式。 2、了解血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理，掌握顯微計(jì)數(shù) 的原理及方法 。 3、學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的方法。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,實(shí)驗(yàn)原理,酵母菌觀察 酵母菌是單細(xì)胞真核生物，菌體比細(xì)菌大且不運(yùn)動(dòng)。繁殖方式以無(wú)性為主（芽殖或裂殖），有性繁殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子。 直接計(jì)數(shù)法 直接計(jì)數(shù)法是利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。 死活細(xì)胞鑒定,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒

25、定,基本原理死活細(xì)胞鑒別原理,美藍(lán)（氧化型） 藍(lán)色,美藍(lán)（還原型） 無(wú)色,酵母活細(xì)胞,新陳代謝,還原能力,試劑與器材,1、材料 釀酒酵母 2、試劑 0.05%和0.1%的呂氏堿性美藍(lán)液、革蘭氏染色用 的碘液。 3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈等。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,實(shí)驗(yàn)步驟（1）,死活細(xì)胞鑒定（美藍(lán)浸片觀察） 在載玻片中央加一滴0.1美藍(lán)染色液，挑菌混勻； 傾斜緩慢放置蓋玻片； 放置3min后鏡檢； 染色半小時(shí)后再次進(jìn)行觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量是否增加；,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,實(shí)驗(yàn)步驟（2）,計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 鏡檢計(jì)數(shù)室，去污，

26、清洗，吹干； 蓋上蓋玻片，菌懸液于邊緣滴一小滴，滲入，使充滿菌液； 顯微鏡計(jì)數(shù) 加樣后靜止5min，每個(gè)小格內(nèi)510個(gè)菌體，取5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）計(jì)數(shù)；代入公式計(jì)算結(jié)果。 1ml菌液中的總菌數(shù)N/52510M (N為5個(gè)中方格中總菌數(shù)，M為菌液稀釋倍數(shù)） 清洗。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,酵母菌的顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu),酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,注意事項(xiàng),1、酵母菌制片時(shí)，菌體不能過(guò)多。 2、染色時(shí)間要掌握好。 3、血球計(jì)數(shù)板清洗是不能用手或者別的硬物擦拭。 4、如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)

27、右線，以減少誤差。 5、對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。,酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計(jì)數(shù)及死活細(xì)胞的鑒定,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,相關(guān)理論知識(shí)（1）,鏈霉菌屬是放線菌中種類最多、分布最廣、 形態(tài)特征最典型的類群。,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,放線菌是絲狀菌（G+），形態(tài)與絲狀真菌相似，但是其菌絲由原核細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，最適pH與細(xì)菌相似。主要以孢子方式進(jìn)行無(wú)性繁殖。,相關(guān)理論知識(shí)（2）,The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基內(nèi)菌絲）

28、and aerial mycelium （氣生菌絲）with chains of conidiospores（分生孢子）,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,分生孢子絲,瓊脂表面,基內(nèi)菌絲,氣生菌絲,The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium （基內(nèi)菌絲）and aerial mycelium（氣生菌絲） with chains of conidiospores（分生孢子）,分生孢子絲,瓊脂表面,基內(nèi)菌絲,氣生菌絲,The cross section of an actinomycete colony

29、 showing the substrate mycelium（基內(nèi)菌絲） and aerial mycelium （氣生菌絲）with chains of conidiospores（分生孢子）,相關(guān)理論知識(shí)（3）,霉菌是絲狀真菌的俗稱，意即“發(fā)霉的真菌”，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實(shí)體。 屬異養(yǎng)型真核微生物，具有絲狀或管狀結(jié)構(gòu)，單個(gè)分支稱為菌絲。菌絲形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)稱為菌絲體。,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,相關(guān)理論知識(shí)（4）,有隔菌絲：有隔菌絲中有橫隔膜將菌絲分隔成多個(gè)細(xì)胞，在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞核的分裂伴隨著細(xì)胞的分裂，每個(gè)細(xì)胞含有一至多個(gè)細(xì)胞核。橫隔膜可以使

30、相鄰細(xì)胞之間的物質(zhì)相互溝通。如曲霉和青霉。 無(wú)隔菌絲：菌絲中無(wú)橫膈膜，整個(gè)細(xì)胞是一個(gè)單細(xì)胞，菌絲內(nèi)有許多核，在生長(zhǎng)過(guò)程中只有核的分裂和原生質(zhì)體質(zhì)量的增加，沒(méi)有細(xì)胞數(shù)目的增多。如毛霉和根霉。,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,根霉,黑曲霉,青霉,青霉,相關(guān)理論知識(shí)（6）,無(wú)性繁殖：Asexual spores 游動(dòng)孢子(Simblospore) 節(jié)孢子(Arthrospores) 孢囊孢子（Sporangiospores） 分生孢子等（Conidiospores） 有性繁殖： Sexual spores 卵孢子(Oospores) 接合孢子 (Zygospores) 子囊孢子(Ascospores),放線

31、菌與霉菌的形態(tài)觀察,孢囊孢子（Sporangiospores are formed within a sporangium ）,分生孢子 Conidiospores,目的要求,1.了解放線菌、霉菌的形態(tài)觀察的原理。 2.學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法。 3.初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,實(shí)驗(yàn)原理,本實(shí)驗(yàn)采用的是插片法觀察放線菌和霉菌。將放線菌或霉菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌的蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌或霉菌的菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長(zhǎng)而附著在蓋玻片上。觀察時(shí)，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌或霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的特征，而且

32、便于觀察不同生長(zhǎng)期的形態(tài)。,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,試劑與器材,1、材料 各種霉菌及放線菌菌種 2、試劑 查氏培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基、乙醇 3、器材 接種環(huán)、酒精燈、脫脂棉、鑷子、載玻 片、蓋玻片、經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿、試管、超 凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、顯微鏡,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,實(shí)驗(yàn)步驟,倒平板 將培養(yǎng)基熔化后，倒20毫升左右于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后使用。 接種 無(wú)菌操作將霉菌和放線菌分別劃線接種到培養(yǎng)基上 插片 將滅菌的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基中，插入深約為1/2或1/3。 培養(yǎng) 將接菌及插片結(jié)束后的培養(yǎng)皿放入28的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 鏡檢 培養(yǎng)后菌絲體生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上，小心用鑷子將蓋玻片抽出，輕

33、輕擦去生長(zhǎng)較差的一面的菌絲體，將生長(zhǎng)良好的菌絲體面向的載玻片，壓放于載玻片上。直接在顯微鏡下觀察。 記錄繪圖,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,根霉圖片（1）,根霉圖片（2）,根霉圖片（3）,曲霉圖片24h曲霉,曲霉圖片24h曲霉足細(xì)胞,曲霉圖片,青霉圖片（1）,青霉圖片（2）,青霉圖片（3）,關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng),1、倒平板要厚一些，接種時(shí)劃線要密。 2、插片時(shí)要有一定角度并與劃線垂直。 3、觀察時(shí)，宜用略暗光線，先用低倍鏡找到適當(dāng)視 野，更換高倍鏡觀察。 4、如果用0.1%美藍(lán)對(duì)培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀 察，效果

34、會(huì)更好。,放線菌與霉菌的形態(tài)觀察,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,相關(guān)理論知識(shí)（1）,乳酸菌 乳酸菌是一類能在碳水化合物中，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，它在酸奶中大量存在。 乳酸菌形態(tài) 球形、類球狀、短桿或桿狀，有些細(xì)胞有芽孢。 代謝產(chǎn)物 以乳酸為主要代謝產(chǎn)物，有些乳酸菌可以產(chǎn)生乳鏈菌肽（Nisin)，乳鏈菌肽有抑菌活性。,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,相關(guān)理論知識(shí)（2）,乳鏈菌肽(Nisin)是世界上公認(rèn)安全的防腐劑，是一種由微生物代謝所產(chǎn)生的具有很強(qiáng)殺菌作用的天然代謝產(chǎn)物。 Nisin本身具有熱穩(wěn)定性，并耐酸、耐低溫貯藏，Nisin的溶解性、穩(wěn)定性都與溶液的pH值密切相關(guān)，溶解度隨pH值的下降而提高，pH值

35、2.5時(shí)溶解度為12%, pH值為5.0時(shí)下降到4%，在中性及堿性條件下幾乎不溶解。 Nisin能抑制大部分革蘭氏陽(yáng)性菌及其芽抱的生長(zhǎng)和繁殖，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及梭狀芽抱桿菌屬和芽抱桿菌屬的細(xì)菌，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,目的要求,掌握乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定方法 熟悉瓊脂擴(kuò)散法的操作 了解乳鏈菌肽的抑菌作用,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,實(shí)驗(yàn)原理,乳鏈菌肽的微生物測(cè)定方法有比濁法和瓊脂擴(kuò)散法等。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際上最普遍應(yīng)用的瓊脂擴(kuò)散法來(lái)測(cè)定乳鏈菌肽效價(jià)。它是將規(guī)格一定的不銹鋼小管置于帶菌瓊脂平板上或者在瓊脂平板上打孔，孔中加入被測(cè)液，放入溫箱

36、培養(yǎng)。在菌體生長(zhǎng)的同時(shí)，被測(cè)液擴(kuò)散到瓊脂平板內(nèi)，抑制或殺死周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生不長(zhǎng)菌的透明的抑菌圈。在一定的范圍內(nèi)，抗菌物質(zhì)的濃度（對(duì)數(shù)值）與抑菌圈直徑（數(shù)學(xué)值）呈直線關(guān)系。因此，根據(jù)抑菌圈的大小，可以求出相應(yīng)的抗菌物質(zhì)的效價(jià)。,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,試劑與器材,1、材料 乳酸乳球菌（中國(guó)菌種保藏中心1.2030）、從酸奶中分離出來(lái)的乳酸乳球菌、枯草桿菌 2、試劑 乳酸乳球菌培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基， 底層瓊脂、頂層瓊脂培養(yǎng)基 注：把鑷子、打孔器、槍頭（1ml、100ul）、5ml的EP管等滅菌。 3、器材 牛津小杯、培養(yǎng)皿、離心機(jī)等,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,培養(yǎng)基,乳酸乳球菌培養(yǎng)基 蔗糖

37、 1%、蛋白胨 0.45%、酵母膏 1%、 K2HPO4 2.84%、NaCl 0.2%、MgSO47H20 0.02%， 配制100ml LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨 1g、酵母粉 0.5g、NaCl 1g 底層瓊脂培養(yǎng)基 胰蛋白胨 0.8g、酵母粉 0.5g、葡萄糖 0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO412H20 0.2g、瓊脂 1g 100ml 頂層瓊脂培養(yǎng)基 胰蛋白胨 0.8g、酵母粉 0.5g、葡萄糖 0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO412H20 0.2g、瓊脂 0.5g 配制100ml,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,實(shí)驗(yàn)步驟,將乳酸乳球菌發(fā)酵液取出20ml于50ml離心管中，

38、用鹽酸調(diào)pH到2，離心。將配好的頂層瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化。 把枯草桿菌的濃度調(diào)成OD600 值為0.16。 在平板中先鋪一層底層瓊脂培養(yǎng)基 待加熱熔化的頂層瓊脂降溫至50左右，加入確定量的枯草桿菌，混合均勻，加入已經(jīng)鋪好底層瓊脂培養(yǎng)基的平板中，每個(gè)平板加5ml。待凝固后打孔 挑出孔內(nèi)瓊脂，往里面加入步驟1中的乳酸乳球菌的上清，加平即可。,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,注意事項(xiàng),指示菌要調(diào)菌液濃度 加指示菌的瓊脂培養(yǎng)基要冷卻到50左右后，再加指示菌 打孔時(shí)要注意不要打裂 乳鏈菌肽發(fā)酵液要先沉降 乳鏈菌肽上清液要加滿平板上的孔,乳鏈菌肽效價(jià)的生物測(cè)定,微生物菌種的保藏,相關(guān)理論知識(shí),菌種是一種重要的生物資

39、源，菌種保藏是重要的微生物基礎(chǔ)工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、不衰、不變，以便于研究與應(yīng)用。微生物菌種的保藏方法有斜面冰箱保存法、石蠟油封藏法、沙土保藏法和冷凍干燥保存法等。其中以斜面冰箱保存法最為簡(jiǎn)便。,微生物菌種的保藏,目的要求,1、了解菌種保藏的基本原理 2、掌握幾種常用的菌種保藏方法。,微生物菌種的保藏,實(shí)驗(yàn)原理,菌種保藏的方法很多。其原理卻大同小異，不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng)造一個(gè)適合長(zhǎng)期休眠的環(huán)境,即干燥、低溫、缺乏氧氣和養(yǎng)料等。使微生物的代謝活動(dòng)處于最低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達(dá)到保藏的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求，應(yīng)該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜面保藏、半固體穿

40、刺、石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易制作。,微生物菌種的保藏,試劑與器材,1、材料 各種需要保藏的菌種及相應(yīng)的培養(yǎng)基、河沙、瘦黃土或紅土。 2、試劑 EDTA、NaAc、10mmol/LTris、液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95%乙醇、10%鹽酸、無(wú)水氯化鈣、食鹽、干冰。 3、器材 無(wú)菌吸管、無(wú)菌滴管、無(wú)菌培養(yǎng)皿、安瓿瓶、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條、干燥器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、,微生物菌種的保藏,斜面低溫保藏,這是一種常用的而且是最簡(jiǎn)便的保藏方法。首先將要保藏的菌種移接到適宜的斜面培養(yǎng)基上。一般采用營(yíng)養(yǎng)豐富的半合成培養(yǎng)基，如PDA培養(yǎng)基（馬鈴

41、薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基），麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基等。為了減少培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將瓊脂用量加到20%。在這些培養(yǎng)基中，最好再加入少許0.2%的K2HP04、KH2PO4、CaCO3等緩沖劑，以中和菌種在保藏過(guò)程中產(chǎn)生積累的有機(jī)酸。 用適宜溫度培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面，選擇菌絲生長(zhǎng)健壯的試管，先用硫酸紙包扎好管口棉塞，再將若干支試管用牛皮紙包好。,微生物菌種的保藏,液體石蠟保藏,將要保藏的菌種接入前面介紹的PDA半合成培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面，選擇生長(zhǎng)健壯的備用。然后選用化學(xué)純的液體石蠟裝入三角瓶?jī)?nèi)，裝至瓶體的/3處，塞上棉塞后包扎，kg/cm2滅菌小時(shí)。滅菌后，放在40恒溫箱中，使水分蒸發(fā)至石

42、蠟液透明為止。冷卻后在無(wú)菌箱(室)內(nèi)，以無(wú)菌操作方法，用無(wú)菌吸管分別注入待保存的各個(gè)試管菌種內(nèi)，注入量以淹過(guò)斜面1cm為宜。 然后塞以橡皮膠塞，用蠟封口，直立于試管架上，放入4冰箱中或常溫下保藏。此法可保藏57年，但最好12年移植一次。使用時(shí)，不必倒去石蠟油，只要用接種針從斜面上挑取小塊菌絲即可(但要盡量少帶石蠟油)。余下的母種可繼續(xù)保藏。由于挑出移接的菌絲塊沾有石蠟，故生長(zhǎng)微弱，必須轉(zhuǎn)接幾次才能恢復(fù)正常。,微生物菌種的保藏,沙土管保藏法,河沙處理 取河沙若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過(guò)篩，棄去粗顆粒，備用。 土壤處理 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過(guò)篩，粗顆粒部分丟掉。 沙土混合 處理妥當(dāng)?shù)暮由撑c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作沙或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，烘干。,微生物菌種的保藏,無(wú)菌檢查 每10支沙土管隨機(jī)抽1支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長(zhǎng)，所有沙土管則