質(zhì)譜發(fā)展歷史-基礎(chǔ)知識

1、第一章 簡介,一.質(zhì)譜的發(fā)展歷史 1906年 J.JThomson在實驗中發(fā)現(xiàn)帶電荷離子在電磁場中的運動軌跡與它的質(zhì)荷比(m/z)有關(guān),并于1912年制造出第一臺質(zhì)譜儀. 1946年 發(fā)明飛行時間質(zhì)量分析器(Time-of-flight Analyzer) 1953-1958年 出現(xiàn)四極桿質(zhì)量分析器(Quadrupole) 1956年 GC-MS開始聯(lián)用 1959年 質(zhì)譜首次用于peptide sequencing 1965年 離子共振質(zhì)譜出現(xiàn) 1968年 電噴霧離子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform ion

2、 cyclotor resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 電噴霧離子源開始用于生物大分子的研究,什么是質(zhì)譜儀?,質(zhì)譜儀是按照離子的質(zhì)荷比(m/z)不同,來分離不同分子量的分子.測定分子量進行成分和結(jié)構(gòu)分析. 離子的生成方式有失去或捕獲電荷(如:電子發(fā)射,質(zhì)子化或去質(zhì)子化) 主要組成部分: 1.進樣部分 2.離子源 3.質(zhì)量過濾器(分析器) 4.離子檢測器,離子源,質(zhì)量過濾/分析器,檢測器,進樣部分 樣品板 LC或GC,EI源 FAB源 MALDI源 ESI源,Quadruopole

3、Ion trap Time-of-flight,電子倍增器 閃爍計數(shù)器,第二章 質(zhì)譜儀的組成,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,+,+,+,+,+,+,+,+,+,第一節(jié) 進樣部分,要求： 大氣壓下的樣品要進入高真空的質(zhì)譜儀，而不影響儀器的真空度。 方式： 進樣板進樣 進樣頭進樣 毛細管進樣（從氣相色譜及液相色譜柱）,第二節(jié)離子源,A :EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要離子化方式,只能用于遠遠小于生物有機分子的小分子(400Da以下)的檢測,樣品需經(jīng)過汽化(通常熱解吸附)進入電離區(qū),與電子流撞擊.電子流傳遞部分能量(多小于

4、6ev)形成離子及部分碎片.,EI的優(yōu)缺點,優(yōu)點 1.級的靈敏度 2.有達10萬個化合物的數(shù)據(jù)庫可快速檢索 3.可根據(jù)碎片方式鑒定未知物 4.從碎片離子判定結(jié)構(gòu),缺點 1.質(zhì)量范圍小 2.有可能汽化前發(fā)生解離 3.碎片過多有時看不到分子離子,FBI快速原子/離子轟擊離子源Fast Atom/Ion Bombardment,使用高能量的氙原子Cs+離子或甘油-NH4+集團噴射樣品靶上的樣品和基質(zhì)表面,基質(zhì)是溶解樣品的非揮發(fā)性溶劑,樣品從基質(zhì)中解吸附并汽化,離子化. 基質(zhì)的作用是溶解樣品;吸收大部分能量,有助于樣品離子化并保護樣品不被高能量撞擊破壞.,FBI優(yōu)缺點,優(yōu)點 1、質(zhì)量數(shù)可以做到7000

5、Da。 2、快速。 3、軟電離方式，碎片離子少。 4、容易引入陽離子形成M+Na,M+K型的正離子。 5、分辨率高?；|(zhì)可作為參照離子進行精確質(zhì)量測定。 6、大質(zhì)量的甘油團形成多電荷可測生物大分子。,缺點 1、質(zhì)量數(shù)高時靈敏度下降嚴重。 2、靈敏度比MALDI,ESI低。 3、碎片少，結(jié)構(gòu)信息少。 4、基質(zhì)多峰，干擾結(jié)果分析。 5、樣品必須能溶于基質(zhì)。 6、非極性物質(zhì)難以離子化。,C: MALDI 激光解吸附離子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI源的出現(xiàn)解決了生物大分子的離子化難題，離子化過程與FBI有相似之處。 1、使用基質(zhì)

6、，但基質(zhì)為固體。 2、 MALDI用脈沖激光束轟擊樣品和基質(zhì)的共結(jié)晶。 對基質(zhì)的要求是能吸收337nm紫外光并氣化，能量由基質(zhì)傳給樣品使樣品一起氣化并離子化。,常用基質(zhì),1、氰基4羥基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羥基肉桂酸 SA 蛋白 3、龍膽酸（2,5二羥基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羥基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器產(chǎn)生短周期脈沖激光，產(chǎn)生的多為單電荷離子，效率很高，即使只有極少的樣品也可分析,常用基質(zhì)結(jié)構(gòu),DHB,SA,CCA,MALDI的優(yōu)缺點,優(yōu)點 1、質(zhì)量數(shù)可達300,000Da。 2、attomole 至femtomole級靈敏度。

7、 3、軟電離方式，無或極少碎片離子。 4、耐鹽（樣品含鹽可達毫摩爾濃度）。 5、適于分析復(fù)雜混合物。,缺點 1、分辨率低。 2、1000Da以下基質(zhì)峰干擾。 3、激光解吸附離子化有可能使樣品光降解。 4、串聯(lián)質(zhì)譜功能較弱，除非接反射裝置進行源后衰變測量。 5、不能分析非共價鍵相互作用。 6、定量時需要內(nèi)校準。 7、如沒有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾。 8、對各種賦形劑的容忍度低（如 含磷酸緩沖液，大于150mM的鹽等。,Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Con

8、centration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT contain anyAzide SDSBrij 35 Tris baseCHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100DMSO TweenDMF ZwittergentGlycerol any other detergentPhosphate buffersSalts and buffers 100 mM,The following components are ACCEPTABLE

9、Acetic or formic acidAcetonitrile, ethanolGuanidine/HCl 4MHexafluoroisopropanol up to 40%MethanolSodium chloride 10 mMUrea 1M,D: ESI離子源Electrospray Ionization,4000v強電場中，樣品溶液通過毛細管噴嘴噴出，帶電液滴被靜電場吸向質(zhì)譜人口，同時伴隨干燥或加熱干燥氣體吹送，使液滴表面溶劑揮發(fā),液滴體積變小，表面電荷密度變大，當同種電荷之間的庫侖斥力達到雷利極限時，突破表面張力，液滴爆裂為更小的帶電液滴，這一過程不斷重復(fù)，使最終的液滴非常細小，

10、呈噴霧狀，此時液滴表面電場非常強大，使分析物離子化，帶單電荷或多電荷。 一般分析物分子量 2000Da帶多電荷,NANO-ESI噴霧照片,ESI特點,1、 ESI產(chǎn)生的生物大分子離子如多肽蛋白等常常帶10個以上電荷，使得m/z大大減小，彌補了四極桿質(zhì)量分析器等質(zhì)量范圍窄的缺點。 2、質(zhì)譜圖顯示的是離子帶不同電荷數(shù)的一系列質(zhì)荷比峰，根據(jù)峰位置換算成質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)。,電荷數(shù)和質(zhì)量數(shù)的計算,已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nk,m/z,相對

11、豐度,mj,mk,ESI優(yōu)缺點,優(yōu)點 1、質(zhì)量數(shù)可達70，000Da 2、靈敏度高達femtomole級。 3、軟電離，可觀察生物分子非共價反應(yīng)。 4、易于和LC串聯(lián)，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液。 5、沒有基質(zhì)干擾。 6、適于聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器做結(jié)構(gòu)分析。 7、帶多電荷，允許質(zhì)量范圍窄的設(shè)備檢測高質(zhì)量數(shù)的離子。 8、帶多電荷，通過計算平均值給出更精確的質(zhì)量數(shù)。 9、特別適于測多肽的修飾。 10、樣品前處理簡單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。,缺點 1、耐鹽能力低。 2、對某些化合物特別敏感，污染難清洗。 3、樣品需先氣化，混合物不適用。 4、帶多電荷，在

12、分析混合物時，產(chǎn)生混亂。 5、定量時需內(nèi)校準。,E: 其他離子化方式,陽離子化: 以非共價鍵結(jié)合的方式向中性分子加上正電荷。 尤其適合質(zhì)子化不穩(wěn)定的的分子，質(zhì)子化是共價鍵結(jié)合，電荷從質(zhì)子向分子發(fā)生轉(zhuǎn)移，這以過程會造成分子的不穩(wěn)定，使分子裂解。 陽離子化沒有這一缺點，常用在ESI離子方式中，糖類非常適合這一電離方式，一般多加Na+. 陰離子化: 分子失去一個質(zhì)子，帶上正電荷，這種離子化方式適合酸性物質(zhì)，如酚類、羧酸和磺酸。,第三章 質(zhì)量分析器（過濾器）,第一節(jié)：質(zhì)量分析器的主要指標 A、質(zhì)量范圍（/） 所能測量的質(zhì)荷比范圍 M+nH B、靈敏度 一定濃度樣品產(chǎn)生響應(yīng)時，最低的濃度值。,n,D、分

13、辨率 質(zhì)譜分辨不同質(zhì)荷比離子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定義為單峰的質(zhì)荷比與其半峰寬之比 b公式定義為相鄰的相交10的兩個峰M M 按a 式計算的分辨率約為b式計算的兩倍。,不同分辨率譜圖效果,E：分子量的表述方式,1、單同位素質(zhì)量monoisotopic mass 最輕的穩(wěn)定同位素的質(zhì)量（也有說自然界中豐度最大的同位素的質(zhì)量）。 只有高分辨率的質(zhì)量分析器才能分離出單同位素峰。,2、化學(xué)平均分子量M 根據(jù)同位素質(zhì)量及豐度計算出平均質(zhì)量，所有元素的平均質(zhì)量給出分子的平均質(zhì)量。 3、最高峰質(zhì)量 即未分辨開質(zhì)譜峰最高處的質(zhì)量數(shù)。 表述方式要看分子量及分辨率而定，當m/z

14、高時單同位素峰已不是豐度最大的峰， m/z 8000時與最高峰質(zhì)量趨于一至。,第二節(jié) 質(zhì)量分析器的種類,A、四極桿質(zhì)量分析器Quadrupole Analyzer A、B極性相反，加上一個直流電壓DC，疊加一個射頻電場RF，掃描時固定RF頻率， DC： RF保持比率不變，數(shù)值遞增，使m/z小到大的離子依次通過，取得一張完整的質(zhì)譜圖。,DC+RF,四極桿質(zhì)量分析器的 優(yōu)點,四極桿質(zhì)量分析器通常與EI、ESI源聯(lián)接 1、能容忍相對低的真空度（約10 x10Torr） 2、m/z可達3000， ESI離子源產(chǎn)生的多電荷生物分子離子m/z正好多在3000以內(nèi)。 3、開銷低廉。,B、離子阱質(zhì)量分析器,三

15、維的四極桿，RF加在環(huán)形電極上。,環(huán)形電極,離子阱質(zhì)量分析器,三維的四極桿，RF加在環(huán)形電極上。,C、飛行時間質(zhì)量分析器 Time-of-Flight Analyzer,離子的E=UZ=mv 飛行時間t=,t=const,L,v,m,z,反射飛行時間質(zhì)量分析器(RETOF-MS),Uref,TOF對真空度的要求非常高10Torr MALDI源一般同時聯(lián)接Time-of-Flight Analyzer和RETOF,D、傅立葉回旋共振質(zhì)量分析器fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance,質(zhì)量精度最高，達0。001,幾種質(zhì)量分析器的比較,第三節(jié)：質(zhì)量分析器的串

16、聯(lián),目的：碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生碎片離子，進行結(jié)構(gòu)解析 Collision-induced dissociation(CID) Ion source ion daughter ion granddaughter ion,選擇離子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,空間串聯(lián)質(zhì)譜儀,A、串聯(lián)四極桿（三級四極桿） triple-Quadrupole Analyzer Q為過濾單元Q為碰撞單元Q為分析單元,幾種檢測方式,1、MS方式： 所有離子通過QQQ到達檢測器。 2、MS/MS方式： Q作為分析器選擇母離子(前體離子），Q作為碰撞室產(chǎn)生子離子，子離子由Q分析。 3、MS方式：,三級四極桿的

17、幾種掃描模式,1、子離子掃描模式：即MS/MS。 2、前體離子掃描模式： Q依次將所有離子輸入Q碰撞解離，Q設(shè)定一個特定子離子值，只檢測此特定子離子， Q與Q聯(lián)接，當檢測器檢測到子離子時，質(zhì)譜儀記錄的是Q中的子離子值，質(zhì)譜圖顯示的是所有產(chǎn)生相同子離子的母離子。 3、中性丟失掃描： Q掃描與Q有一特定質(zhì)量差異的子離子，譜圖顯示的是所有特定中性分子丟失的母離子。,B、三級四極桿飛行時間質(zhì)譜儀Quadrupole time of flight,C、飛行時間飛行時間質(zhì)譜儀Time-of-flight/time-of-flight,時間串聯(lián)質(zhì)譜儀,A、離子阱質(zhì)譜儀：,B、傅立葉回旋共振質(zhì)譜儀Fourie

18、r transform-ion cyclotron resonance,離子進入共振腔后，通過調(diào)控RF，選擇特定的母離子留在腔內(nèi)，再引入惰性碰撞氣體碰撞,產(chǎn)生碎片,并檢測碎片離子，這一過程不斷重復(fù)至MS。,幾種串聯(lián)質(zhì)譜優(yōu)缺點對比,第四章 檢測器,一、電子倍增檢測器： 真空度低，表面易污染，壽命一般12年。,二、光電轉(zhuǎn)換倍增器（閃爍計數(shù)器）,電子發(fā)射撞擊熒光屏，熒光屏發(fā)射光子由光子放大器檢測。光子放大器密封在容器中，光子可穿過密封玻璃，避免表面污染，壽命為5年。,三、HED(High-Energy Dynode Detector),在離子倍增器前加一個加速靜電場，離子加速 后產(chǎn)生更多的二級電子引

19、發(fā)電子雪崩，靈敏度更高。,四、FT-MS,FT-MS本身就是一個檢測器，因為離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的可檢測電流與m/z有關(guān)。,第五章、質(zhì)譜在生物學(xué)中的應(yīng)用,一、肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白。 二、串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白技術(shù),The nomenclature of the common peptide fragment ions developed by Roepstorff and Fohlman,The proposed mechanism of formation of b and y-type ions,三、肽序列標簽技術(shù),通過測部分氨基酸序列，結(jié)合此序列前后的離子質(zhì)量和肽段母離子質(zhì)量進行數(shù)據(jù)庫檢索，稱為肽序列

20、標簽技術(shù)。,四、O標記從頭測序技術(shù),蛋白酶解時，酶解液中H2 O和H2 O各占50， 酶解后肽段的羧基端上的羥基氧 O/ O豐度比1：1，使Y型離子系列的M+2/M同位素峰的豐度高于正常未標記 O的離子的同位素豐度比。,18,18,16,18,16,18,五、磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定,A：MA結(jié)合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,MS,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脫HPO3,MS,通過比較幾級質(zhì)譜圖，比較質(zhì)量數(shù)少80Da或80倍數(shù)的肽段。,B、串聯(lián)質(zhì)譜進行母離子、中性丟失 掃描，分析含HPO3的肽段產(chǎn)生的特征離子，直接從混合肽段中找出磷酸化肽段。,C、PRD-MALDI-MS用源后衰變技術(shù)尋找質(zhì)量數(shù)少80Da或9

21、8Da的肽段來判斷磷酸肽。,D、用IMAC技術(shù)分離/富集磷酸肽對比前后質(zhì)譜變化尋找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金屬親和色譜。IMAC 對磷酸肽有高選擇結(jié)合能力，富集后用高PH或磷酸鹽洗脫后測質(zhì)譜。,E、磷酸化位點的確定,找到磷酸肽后，串聯(lián)質(zhì)譜子離子掃描模式對磷酸肽進行序列分析。,F、磷酸化定量分析,1、N穩(wěn)定同位素標記法：,N培養(yǎng)基,14,15,N培養(yǎng)基,14,2、同位素親和標記法,細胞池1,細胞池2,混合,消除氘,消除氫,親和純化,酶解,MS,磷酸肽或磷酸化蛋白在緘性環(huán)境下發(fā)生消除，同時用親核試劑攻擊形成的雙鍵并發(fā)生加成反應(yīng)，親核試劑一種為氘原

22、子、一種為氫原子，再接上一個親和標簽（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段進行MS檢測。,六、糖基化蛋白的鑒定,A、用糖甙內(nèi)切酶切斷糖鏈與蛋白鏈間的糖甘鍵，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖比較，可知糖鏈的平均質(zhì)量。,B、糖基化位點的確定,先用蛋白酶酶解成含糖鏈和不含糖鏈的肽段，獲得其肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶切除糖鏈，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，含糖肽段發(fā)生丟失位移，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索其序列，找到位點。,C、用凝集素直接提取含糖肽段，再結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析,凝集素對含糖肽段有專一親和性,七、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用,A、穩(wěn)定同位素代謝標記技術(shù)。前面已介紹 B、同位素親和標簽技術(shù),ICAT,

23、專一與Cys共價結(jié)合,優(yōu)缺點,優(yōu)點 1、兼容分析任何條件下的體液、細胞、組織中的絕大部分蛋白。 2、烷化反應(yīng)在鹽、去垢劑/穩(wěn)定劑（如SDS、尿素鹽酸胍等）存在下都可進行。 3、只分析含Cys殘基的肽段，降低分析復(fù)雜性。,缺點 ICAT本身分子量較大（500Da左右）增加數(shù)據(jù)檢索復(fù)雜性。 無法分析不含Cys的蛋白。,Why 2D LC/MS?,可鑒定極端具有pI、疏水性、分子量的蛋白質(zhì) 適合膜蛋白 重復(fù)性好 容易自動化 上樣量大 高靈敏度（溶液酶切） 可根據(jù)樣品靈活配置（但最后一維一般為RP）,Then why SCX/RP/MS?,SCX和RP的分離原理是互補的 SCX按荷電情況，PR按疏水性

24、 流動相是兼容的 pH3，ACN/water/salt SCX流動相中的鹽可以在RP時有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX條件下是穩(wěn)定的,Separation powerPeak capacities,2DE 500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromatography 10protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography50 Ion Exchange

25、 Chromatography 25 Reversed Phase Chromatography 100peptide level 2DLC (IEX/RPC)2,500 Linear IT MSn18,000 mph*,*measurements per hour,(7) Sample Considerations for LC/MS 樣品的要求,The Analyte Must Have Ionizable Groups Amines Carboxylic Acids Ketones, Aldehydes For Best Sensitivity, Work at a pH Where t

26、he Analyte is Ionized Neutral to basic pH (7-9) for acids Acidic pH (3-4) for bases,Sample Considerations for LC/MS,Positive Ion Mode Analyte = (M+H)+ Negative Ion Mode Analyte = (M-H) Basic Compound Sensitive in Positive Ion Mode Acidic Compound Sensitive in Negative Ion Mode,Gel,Gel spot,Proteolyt

27、ic peptides,Mixture of Proteins,Digestion,Proteolytic peptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,o

28、n-line elution by salt plugs to trap column,IEX,off-line gradient elution with “classical”fraction collection,RPC,2D LC的三種配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,on-line 2D-LC,優(yōu)點 全自動 樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整 在線脫鹽、濃縮 自由選擇緩沖鹽,缺點 SCX峰容量有限 ACN濃度在IEX和RPC得一致 兩相分離都沒能在最佳狀態(tài)下進行,off-line SCX with fraction collection,優(yōu)點 兩維分離都有可能在最佳狀

29、態(tài)下進行，得到最好分辨率和峰容量 可自由選擇緩沖體系 樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整 速度快（只需一個SCX操作） SCX餾份可留待以后分析(ESI和MALDI均可）,缺點 自動化程度低,The secret behind sensitivityReducing column dimensions,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,Data dependent MS/MS,基本原則 先做一次全掃描（full

30、MS)，記錄個豐度最高的離子 然后依次對這X個離子進行CID, 做MS/MS(full MS2) 然后再做全掃描, 下一個data dependent MS/MS開始 Dynamic exclusion 某個離子在做了一定次數(shù)（比如2次）的MS/MS后，將在一定時間內(nèi)（比如3min）不再作為侯選離子。,碎片離子的命名,Residue name (A-Z) monoisotopic massaverage mass A71.03711 71.0788 B114.53493114.59625 C103.00919103.1388 D115.02694115.0886 E129.04259129.1

31、155 F147.06841147.1766 G57.02146 57.0520 H137.05891137.1412 I113.08406113.1595 J0.00.0 K128.09496128.1742 L113.08406113.1595 M131.04049131.1925 N114.04293114.1039 O0.00.0 P97.05276 97.1167 Q128.05858128.1308 R156.10111156.1876 S87.0320387.0782 T101.04768101.1051 U150.95364150.034 V99.06841 99.1326 W

32、186.07931186.2133 X111.0111.0 Y163.06333163.1760 Z128.55059128.62315,氨基酸殘基質(zhì)量,ESI-MS/MS vs MALDI-MS/MS why LTQ/LCQ type instrument so popular in proteomics?,主要特點 1 能做高通量、復(fù)雜體系的蛋白質(zhì)鑒定，通量約為每小時鑒定100200個蛋白。 2 動態(tài)范圍寬，能在混有大量高豐度蛋白的體系中，鑒定出痕量的低豐度蛋白。 3如數(shù)據(jù)庫中檢索不到結(jié)果，可自動進行de novo的測序。 4集成ICAT或其它同位素標記的蛋白定量方法。 5 能測定多種翻譯

33、后修飾（如：磷酸化、糖基化等）的個數(shù)和位點。 6 能夠測定寡核苷酸序列。 7 能夠解析蛋白的一些共價和非共價的相互作用。 8能夠表征藥物、天然產(chǎn)物等的結(jié)構(gòu)，推測其斷裂機理，進行藥物代謝研究。 9對化合物進行精確定量分析。 10靈敏度高達fmol級，分辨率高，可進行超高分辨掃描。,Why nanospray,提高靈敏度,Protocol for a Keratin-Free Environment,1) Perform as much work as possible in a biological safety cabinet (BSC)or laminar flow hood 2) Assume that everything in the