液相色譜柱的選擇

1、液相色譜柱的選擇、使用、維護(hù)和常見(jiàn)故障及排除液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱；反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷 基官能團(tuán)（ODS ）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有 C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換 柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重點(diǎn)介紹反相色譜柱的選擇和使用：一、反相色譜柱的選擇1 柱子的PH值使用范圍反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動(dòng)相的PH值小于2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致

2、鍵合相 的水解；當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱 人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。如果流動(dòng)相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí)，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的 Acclaim 柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5 的柱子。2 填料的端基封尾（或稱封口）把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對(duì)極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的 樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。3 .戴安公司Acclaim 柱

3、子介紹一極性圭寸尾C16固定相柱戴安公司有28種類型的柱子，Acclaim反相柱填料高純，金屬含量極低，完全封尾。PH 2-9范圍內(nèi)兼容，低流失，高柱效。尤其是 2003年推岀的Acclaim 極性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰 氨-O鏈接鍵的色譜柱，具極低的硅羥基活性，能在極性溶劑甚至100%水的條件下長(zhǎng)期使用。對(duì)酸性和堿性化合物有極為尖銳的好的色譜峰形，與現(xiàn)有的一流色譜柱相比有更好的立體選擇性。（下圖是Acclaim 極性封尾C16柱和市售極性封尾一流色譜柱分離酸性化合物譜圖的比較）二、液相色譜柱的使用色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。

4、在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱岀廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（岀廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件），只有這 樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異 而有所不同。1、樣品的前處理a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。b、 使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。C、使用0.45呵的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。2、流動(dòng)相的配制液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以 下的特點(diǎn)：a、 流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)c、 流動(dòng)相的黏度要

5、盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命（可運(yùn)用提 高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。d、 流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的 溶劑配制。e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以 防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、流動(dòng)相流速的選擇因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm 的色譜柱，流速一般選擇 1ml /min ,對(duì)于內(nèi)徑為

6、4.0mm 柱，流速0.8ml /min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。a 含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。b 流動(dòng)相要求使用0.45 m濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。c. 使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。三. 色譜柱的維護(hù)1. 色譜柱的平衡反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈 /水中的。新柱應(yīng)先使用10 - 20倍柱體積的甲醇或乙腈沖 洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相

7、和乙腈/水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的“補(bǔ)償，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)！操作步驟：a. 平衡開(kāi)始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試 劑流速如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡）b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過(guò)渡即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗 30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。2 .色譜柱的再生長(zhǎng)期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）?？梢詫?duì)色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的

8、泵進(jìn)行柱子的再生。建議用來(lái)沖洗柱子的溶劑體積色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積125-4mm1.6ml30ml250-4 mm3.2ml60ml250-10mm20ml400ml選擇再生方法：極性固定相（如Si, NH2* , DIOL基色譜填料）的再生：正庚烷-氯仿-乙酸乙酯-丙酮-乙醇-水 *非極性固定相（如反相色譜填料 RP 18 , RP 8 , CN等）的再生：水-乙腈-氯仿（或異丙醇）-乙腈-水a(chǎn). 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流岀。b. 0.05M 稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜

9、柱，如果簡(jiǎn)單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用 0.05M稀硫酸沖洗非常有效。3.色譜柱的維護(hù)a 使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相 /離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）b 大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2 - 7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的 pH范圍c. 避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化d 流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理e. 如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中f. 氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑， 以避免腐蝕。怎樣選擇色譜柱現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞的

10、一個(gè)重要指標(biāo)是色譜填的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬， 因此，要做合適的選擇，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。一.硅膠基質(zhì)填料1 正相色譜正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如 (NH2, APS)和氰基團(tuán) (CN, CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅輕基(SiOH)或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極 性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，女口：正己烷(Hexane)、氯仿(Choroform)、二氯甲烷(Methyle ne Cloride)等。2, 反相色譜反相色譜用的填料常是

11、以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖掖與甲醇、乙情等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份最先被沖洗出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保 留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS) C4(Butyl)、C6H (Phenyl)等。-聚合物填料聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸醋等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在pH值為1 一 14均可使用。相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離 非常有效。現(xiàn)有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。三、其它無(wú)機(jī)填

12、料 其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合 相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多 孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。 石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何 PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于 HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn) 定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可以在 PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用 也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH1-14，溫度可達(dá)100 C。由于氧化鋯填料是最近幾年才開(kāi)始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行之中。怎樣選擇填料粒度 目前，商品化的色譜填料粒度從 1um到超過(guò)30um均有銷售，而目前分析分 離主要用3和5um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小， 柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于 3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分 離度，但不是唯一的因素。如