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文檔簡介

1、發(fā)酵法生產丙酸的工藝研究發(fā)酵法生產丙酸的工藝研究丙酸是一種重要的工業(yè)產品,目前主要以化學法生產。隨著化石原料的資源匱乏,化學品的生物制造越來越重要,丙酸的發(fā)酵法生產技術成為研究新熱點。謝氏丙酸桿菌(propionibacterium shermanii)w125是工業(yè)化生產腺苷鈷胺素(維生素b_(12)的優(yōu)秀菌株,該菌株發(fā)酵胞內積累腺苷鈷胺素的同時胞外積累丙酸和乙酸,由于丙酸產量不足2%,沒有提取的經濟價值而隨廢水排放,造成浪費與污染。本課題研究的主要內容就是維持維生素b_(12)發(fā)酵產率不變的前提下,提高胞外丙酸的產量,為工業(yè)化聯產丙酸和維生素b_(12)奠定基礎。主要研究成果如下:建立了簡

2、便、精確測定丙酸、乙酸和腺苷鈷胺素的色譜方法。調查了propionibacterium shermanii w125的代謝特性,確立了標準化三級發(fā)酵操作程序。以謝氏丙酸桿菌w125為出發(fā)菌株,經紫外誘變、定向篩選分離獲得一株生長快、產酸高、維生素b12產量不降低的耐滲突變菌株w321。研究了p.shermanii w321的批次發(fā)酵,結果表明該菌株在葡萄糖6%,玉米漿 2.5%(干物質),磷酸二氫鉀0.2%,氯化鈷10 mg/l,接種量為20%,培養(yǎng)溫度30,ph 6.5條件下,發(fā)酵周期為66 h,丙酸產量 2.87%,維生素b_(12)產量42g/ml。與w125發(fā)酵相比,丙酸產量提高3 6

3、.7%,發(fā)酵周期縮短30 h。研究了補糖工藝對p.shermanii w321產酸的影響:初始葡萄糖6%,發(fā)酵48 h、72 h、108 h分別補入3%的葡萄糖,最終產酸達到 4.5%,糖酸轉化率為30%,濕重為 7.82%,維生素b_(12)產量44g/ml,發(fā)酵周期168 h,與批次發(fā)酵工藝比,丙酸終濃度提高5 6.8%、濕重提高1 1.6%、維生素b_(12)提高 4.7%,發(fā)酵周期延長102 h。研究了抗?jié)B劑ks對p.shermanii w321產酸的影響,結果表明ks可以明顯加速菌體的生長和產酸速率。結合補糖發(fā)酵工藝,在含有0.3%ks的條件下,初糖濃度提高到9%,60 h、84 h

4、分別補糖3%,發(fā)酵周期114 h。丙酸產量達 5.35%,糖酸轉化率為3 6.1%,濕重為9.9%,維生素b_(12)產量達到51g/ml,發(fā)酵周期114 h,與6%初糖的補料發(fā)酵工藝比,丙酸終濃度提高了1 8.9%,糖酸轉化率提高20.3%,濕重提高2 6.6%,發(fā)酵周期縮短54 h,維生素b_(12)產量提高1 5.9%。發(fā)酵液經過濾后,菌體沉淀用于維生素b_(12)的提取,過濾上清液經脫色處理后可以得到無色透明的液體,為工業(yè)法制備丙酸提供了依據。首次報道了減壓條件下,p.shermanii w321的發(fā)酵動力學變化,發(fā)現,負壓(-0.07mpa)發(fā)酵細胞生長量和產物合成都降低,從代謝循環(huán)

5、途徑看,co_2參與了wood-werkman途徑中由甲基丙二酰coa轉羧酶催化的轉羧反應,減壓可能降低了發(fā)酵液中co_2的水平,影響co_2參與轉羧反應,最終使丙酸合成和細胞生長量降低??傊?本實驗通過對p.shermanii w125的誘變和對突變株發(fā)酵工藝的研究,使丙酸發(fā)酵水平由2%提高到 5.35%,提高幅度268%,維生素b_(12)由40g/ml提高到51g/ml,提高幅度20.7%。本文的研究工作使發(fā)酵法生產丙酸并聯產維生素b_(12)技術體系進一步成熟。 摘要4-6abstract6-11第1章 緒論11-19 1.1 丙酸的性質和用途11 1. 1.1 丙酸的性質11 1.

6、1.2 丙酸的用途11 1.2 丙酸的市場11-13 1. 2.1 世界丙酸市場11-12 1. 2.2 中國丙酸市場12-13 1.3 丙酸的生產方法13-14 1. 3.1 化學合成法13-14 1. 3.2 微生物發(fā)酵法14 1.4 丙酸發(fā)酵工藝的研究現狀14-18 1. 4.1 發(fā)酵菌種14 1. 4.2 發(fā)酵機理14-15 1. 4.3 發(fā)酵工藝15-17 1. 4.4 丙酸分離提取工藝17 1. 4.5 發(fā)酵液中丙酸含量檢測17-18 1.5 發(fā)酵法生產丙酸面臨的問題18 1.6 本課題主要研究的內容18-19第2章 發(fā)酵液中丙乙酸快速氣相色譜檢測方法建立19-26 2.1 材料與

7、方法19-21 2. 1.1 材料及發(fā)酵培養(yǎng)19-20 2. 1.2 方法20-21 2.2 結果與討論21-25 2. 2.1 線性關系21-23 2. 2.2 測定方法的重復性檢驗23 2. 2.3 測定方法的精密度檢驗23-24 2. 2.4 發(fā)酵液中丙乙酸測定24-25 2. 2.5 發(fā)酵液中測定方法的重復性檢驗25 2.3 小結25-26第3章 腺苷鈷胺素快速液相色譜檢測方法建立26-35 3.1 次級代謝產物維生素b_(12)26-30 3. 1.1 維生素b_(12)結構及性質26-27 3. 1.2 維生素b_(12)的功能及市場27 3. 1.3 維生素b_(12)的生產工藝

8、及提取27-28 3. 1.4 維生素b_(12)的檢測28-30 3.2 發(fā)酵液中維生素b_(12)的檢測30-34 3. 2.1 材料與方法30-31 3. 2.2 結果與討論31-33 3. 2.3 結果分析33-34 3.3 小結34-35第4章 菌株代謝特性及標準化三級發(fā)酵35-43 4.1 實驗材料及方法35-36 4. 1.1 實驗菌種及儀器35 4. 1.2 主要試劑35 4. 1.3 檢測方法35-36 4.2 propionibacterium shermanii w125基本生物學特性36-41 4. 2.1 丙酸桿菌屬及謝氏丙酸桿菌w125菌株的基本特性36-37 4.

9、 2.2 w125菌株的碳源需求37 4. 2.3 w125菌株的形態(tài)及發(fā)酵產物37-39 4. 2.4 w125菌株的耐滲研究39-40 4. 2.5 反饋抑制的研究40-41 4.3 標準化三級發(fā)酵操作程序41-42 4. 3.1 三級發(fā)酵過程41-42 4. 3.2 標準操作程序42 4.4 小結42-43第5章 菌種誘變與抗?jié)B篩選43-46 5.1 實驗材料及方法43 5.2 紫外誘變及篩選方法43-45 5. 2.1 菌種誘變及抗?jié)B性篩選策略43-44 5. 2.2 發(fā)酵復篩44-45 5.3 小結45-46第6章 批次發(fā)酵工藝研究46-53 6.1 實驗材料及方法46-47 6.

10、1.1 實驗菌種46 6. 1.2 主要儀器46 6. 1.3 主要試劑46 6. 1.4 檢測方法46-47 6.2 實驗結果及討論47-52 6. 2.1 批次發(fā)酵工藝研究47-51 6. 2.2 優(yōu)化后批次發(fā)酵生長曲線51-52 6.3 小結52-53第7章 分批補料發(fā)酵工藝研究53-61 7.1 實驗材料與方法53 7.2 實驗結果及討論53-58 7. 2.1 分批補料發(fā)酵工藝53-55 7. 2.2 ks對分批補料工藝的影響55-58 7. 2.3 分批補料工藝氮源加入量研究58 7.3 發(fā)酵上清液的脫色58-60 7.4 小結60-61第8章 負壓發(fā)酵實驗61-65 8.1 實驗材料與方法61-62 8. 1.1 實驗菌種6

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