蛋白質(zhì)表達和抗體制備課件

1、蛋白質(zhì)表達和抗體制備,1,蛋白質(zhì)表達,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,2,常用蛋白表達系統(tǒng)(host),原核：大腸桿菌。 真核：酵母、昆蟲、哺乳動物、植物。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,3,大腸桿菌表達系統(tǒng),大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。 優(yōu)越性： 對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調(diào)控機理已有了深刻了解； 商品化的載體和菌株種類非常齊全； 表達效率高； 易培養(yǎng)，成本低。,缺點： 因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體； 蛋白質(zhì)不能糖基化； 其內(nèi)毒素很難除去。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,4,酵母表達系統(tǒng),優(yōu)越性： 蛋白可糖基化，有相對正確的天然結構，可很好的生產(chǎn)分泌

2、型蛋白； 表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實現(xiàn)高效率表達； 表達載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量 擴增。 易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。,缺點： 糖基化與哺乳動物有所差別； 培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,5,昆蟲細胞表達系統(tǒng),利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞體系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達方式。 優(yōu)越性： 重組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配； 可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體； 可進行

3、分泌表達。,缺點： 糖基化與哺乳動物有所差別； 表達量有限； 作為藥物宿主細胞未被FDA認可； 培養(yǎng)成本高。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,6,哺乳動物細胞表達系統(tǒng),哺乳動物細胞常用于表達高活性的人源重組蛋白。 優(yōu)越性： 糖基化與人源蛋白一致； 能表達天然結構的完整蛋白，活性很高； 可進行分泌表達。,缺點： 表達量低； 培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,7,植物表達系統(tǒng),優(yōu)越性： 能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)。 易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。 在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢。,缺點： 不易提取與純化,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,8,Factors in E.coli pr

4、otein expression,Vector Strain Growth conditions,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,9,原核表達載體眾多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融合表達)等。 各載體適應的菌株也不盡相同pET(BL21(DE3)、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。 對于我們來說，最常用和最需掌握的是pET表達系統(tǒng),表達載體(Vector),蛋白質(zhì)表達和抗體制備,10,Expression plasmid features,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,11,Lac operon,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,12,In

5、duction of expression,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,13,原核表達宿主菌,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,14,所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta及Tuner都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表達菌 AD494 (DE3)和BL21trxB (DE3)具有trxB 突變，而Origami (DE3)，Origami B (DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株帶有trxB 和gor雙突變。擁有trxB 和gor突變

6、的菌株比單具 trxB 突變的菌株更有可能促進二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高 多數(shù)氨基酸有不只一個密碼子，而不同的生物使用這61 種密碼子的偏好性不同。每種細胞里，tRNA種類和數(shù)量直接反映了其mRNA 使用密碼子的種類和數(shù)量的偏好性。當外源目的基因mRNA 在E.coli里過表達，由于密碼子偏愛性不同，會因為缺乏某種或某幾種tRNA，直接導致翻譯終止或錯誤。tRNA不足會造成翻譯停頓，早期翻譯停止，移碼突變，和氨基酸錯摻等問題。Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA 水平，這些蛋白的表達會大幅度提高。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備

7、,15,表達條件,培養(yǎng)基 抗生素 誘導劑 誘導溫度 誘導時機 誘導時間,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,16,載體對表達的影響,pET32,BL21(DE3),表達蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD),pET43,BL21(DE3),表達蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD),N I I I M I p s p s,M N I S P,U:Uninduced crude extract I:Crude extract after induced S:Lysis supertanant P:Lysis precipitation,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,17,表達條

8、件對表達的影響,pET21,BL21(DE3)-RIL,表達的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD),U:Uninduced crude extract I:Crude extract after induced S:Lysis supertanant P:Lysis precipitation,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,18,增加可溶性和折疊,降低蛋白合成速率。 溫度。 裂解緩沖液的性質(zhì)。 融合標簽 二硫鍵,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,19,pET載體E.coli表達蛋白流程,制備pET載體 制備插入DNA 將插入片段插入到pET載體上 轉(zhuǎn)化表達宿主菌 誘導/優(yōu)化表達目的蛋白 放大實驗 純化目的

9、蛋白,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,20,蛋白抗體制備,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,21,多克隆抗體：由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。 單克隆抗體：由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,22,據(jù)文獻及DNAstar

10、軟件分析，確定各蛋白最可能抗原區(qū)序列，Primer Premier5.0軟件設計引物，從基因組，擴增目的基因?？寺≈羛ET28a載體上。轉(zhuǎn)化至DH5a中，經(jīng)PCR驗證重組子。重組子質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，進行小量誘導表達，確認最適條件后，進行大量誘導表達，提取大腸桿菌包涵體，溶菌酶處理，添加去垢劑，超聲破碎后，溶于8M Urea中，經(jīng)鎳柱層析咪唑洗脫，過夜透析，無菌過濾后，免疫家兔，通過化學發(fā)光Western印跡確定多克隆抗血清的效價。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,23,抗原基因構筑 ： 通過設計的抗原序列aa的個數(shù)，加上載體上含組氨酸標簽序列的42aa，計算是否達到抗體注射免疫家兔的

11、要求（17-25kDa之間）,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,24,誘導表達靶蛋白 ： PCR驗證基因產(chǎn)物是否插入載體。轉(zhuǎn)化至DH5a中測序，再轉(zhuǎn)化至BL21中小量誘導表達各蛋白。探索蛋白表達最合適的條件，如溫度、誘導時間、IPTG濃度。,0h 2h 4h 6h,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,25,大量誘導表達，分離包涵體 ： 過夜培養(yǎng)25ml菌液，在5：1 的錐形瓶:培養(yǎng)基中按1：50比例加入過夜菌液，30-35 ，0.4mM IPTG ，按上述優(yōu)化條件大量誘導表達靶蛋白。5000g,15min,棄上清，加入Binding buffer (-Urea,20mM PBS(pH 7.8),500mM NaCl)懸

12、浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至終濃度1mg/ml，室溫放置30min。加入1% Triton-X-100，冰中放置10min。超聲破碎120W，4s，間隔4s,5min。 上清另存用于檢測。用Binding buffer (-Urea)懸浮洗滌可溶性雜蛋白。上清另存用于檢測。沉淀用Binding buffer (+8M Urea)懸浮。取少量上清檢測。其于凍存用于純化。,control,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,26,靶蛋白純化 : 0.45um 濾器(whatman)去除細菌蛋白碎片，以利于進行組氨酸標簽表達蛋白的鎳柱層析純化。對蛋白進行定量（牛血清白蛋白法）。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,

13、27,鎳柱層析 : 層析柱（(Poly-Prep Chromatography Column, BIORAD)中加入1.5ml 50% Ni-NTA His Bind Resin，自然沉降，無菌水沖洗，3ml binding buffer(+8M Urea )平衡。（流速10ml/h）6ml （至少3ml）binding buffer(+8m Urea)洗柱，4ml washing buffer(20mM PBS, pH 6.0, 500mM NaCl,8M Urea)洗柱 。6ml 10mM (binding buffer +),50mM,100mM, 150mM,200mM buffer依

14、次洗柱，洗脫靶蛋白。5ml無菌水沖洗。3 ml Binding buffer (+8M Urea )平衡。保留2ml Binding buffer (+8M Urea)于柱中，保存于4。 層析后蛋白樣品需經(jīng)過透析使Urea濃度8M降至2M，和中性條件(pH 7.2, PBS) 原理：His標簽是蛋白質(zhì)重組技術中經(jīng)常用到的一種標簽，其序列為六個組氨酸HHHHHH， 其特點是分子量小，基本不改變蛋白質(zhì)的生物結構，不改變蛋白質(zhì)的溶解性，更重要的是它使蛋白質(zhì)的純化變得極為方便，根據(jù)組氨酸上的咪唑環(huán)可以與二價金屬離子結合的原理，人們可以利金屬離子親和層析技術純化帶有His標簽的蛋白，即將含有目的蛋白的裂解液通過固定的二價金屬離子（通常是二價Ni離子）填料，帶有6*his標簽的蛋白質(zhì)即與填料結合，其它蛋白不與填料結合，最后再用高濃度的咪唑即可將目的蛋白洗脫下來。,蛋白質(zhì)表達和抗體制備,28,透析 ： 處理好的透析袋，裝入約10ml層析后蛋白樣品(10-15mg)。置于5M Urea PBS(pH 7.2)中，磁力攪拌機上3h，更換至2M,2M Urea PBS (pH 7.2)，各透析3h，透析后分裝蛋白樣品，0.22um濾器(whatman)過濾，除菌。定量，分裝。SDS-Urea-PAGE(15%)檢測。 原理： 透析是利用半透性膜將待純化蛋白質(zhì)包裹,沉