醫(yī)學(xué)生物化學(xué)課件--11

1、.,第十一章 轉(zhuǎn)錄Transcription,轉(zhuǎn)錄-生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程 轉(zhuǎn)錄所需的酶叫RNA聚合酶（依賴DNA的RNA聚合酶） 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn),相同點(diǎn)：1. 都以DNA為模板 2. 原料為核苷酸 3. 合成方向均為53方向 4. 都需要依賴DNA的聚合酶 5. 遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律 6. 產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈,.,不同點(diǎn)： 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 兩股鏈均作為模板 模板鏈作為模板 原料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 子代DNA雙鏈 mRNA;tRNA;rRNA 配對(duì) A-T；G-C A-U；T-A；G-C 引物 需RNA引物 - 方式(特點(diǎn)) 半保留

2、復(fù)制 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄,.,第一節(jié) 模板和酶,一、轉(zhuǎn)錄模板 兩股DNA單鏈中只有一股可轉(zhuǎn)錄,可作為模板轉(zhuǎn)錄成RNA的一股稱為模板鏈，對(duì)應(yīng)的一股互補(bǔ)鏈稱為編碼鏈。能轉(zhuǎn)錄出mRNA然后指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的部分稱為結(jié)構(gòu)基因。其余的DNA可能轉(zhuǎn)錄(rRNA，tRNA)，也可能不轉(zhuǎn)錄,不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄: DNA分子上一股可轉(zhuǎn)錄,另一股不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。,.,.,二、RNA聚合酶,反應(yīng)特點(diǎn) （1）以四種核苷三磷酸（NTP）為底物，以DNA為模板； （2）以53方向合成； （3）無(wú)需引物，直接在模板上合成RNA鏈； （4）堿基配對(duì)是：A-U和G-C； （5）DNA的兩條鏈中僅一條鏈可作模板，該鏈稱模板鏈（

3、一般為負(fù)鏈），另一條鏈稱編碼鏈（一般稱為正鏈）。,.,（一）原核生物的RNA聚合酶 大腸桿菌 分子量為480kD，由四個(gè)亞基組成2(全酶) 去掉亞基稱為核心酶,RNA聚合酶各亞基及其功能,亞基為起始因子，能使RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上。因子具有特異性,.,（二）真核生物的RNA聚合酶 三種RNA聚合酶、，它們專一地轉(zhuǎn)錄不同的基因,其轉(zhuǎn)錄過(guò)程和產(chǎn)物也各不相同。三種RNA聚合酶對(duì)鵝膏覃堿的敏感性反應(yīng)不同。,.,三 酶與模板的辨認(rèn)結(jié)合,原核生物的RNA聚合酶是結(jié)合到DNA的啟動(dòng)區(qū)開始轉(zhuǎn)錄的，靠其亞基辨認(rèn)啟動(dòng)區(qū)。啟動(dòng)區(qū)具有共有的序列稱為保守序列或一致性序列。,.,-35區(qū)的序列與起始點(diǎn)的辨認(rèn)有

4、關(guān),稱為辨認(rèn)位點(diǎn), -10區(qū)的序列稱為Pribnow盒(box) 結(jié)合位點(diǎn),標(biāo)記應(yīng)該為+1,.,第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄裝置,一、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn) DNA序列按編碼鏈（與RNA鏈一樣）書寫，由左至右為53方向。與mRNA序列相同的為正鏈（編碼鏈），互補(bǔ)的鏈為負(fù)鏈（模板鏈）。 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)：即每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的起點(diǎn)。該點(diǎn)的核苷酸標(biāo)號(hào)為+1。右側(cè)為下游，用正的數(shù)碼表示；左側(cè)為上游，用負(fù)的數(shù)碼表示。,.,二、啟動(dòng)子 即轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)序列。 1、大腸桿菌基因組的啟動(dòng)子 （1）Pribnow框（-10序列）：起點(diǎn)上游約-10處，保守序列TATAAT，-10序列有助于DNA局部雙鏈解開（A-T配對(duì)易解開） （2）識(shí)別區(qū)（-35序列）

5、：中心位置約在-35處，保守序列TTGACA；-35序列提供了RNA聚合酶識(shí)別的信號(hào),.,2、真核生物基因組的啟動(dòng)子 （1）Hogness框（TATA框）：中心在-25-30處，保守序列TAAA(T)AA(T)，有助于DNA局部解開 （2）CAAT框：-75處，保守序列GGT (C)CAATCT，與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān) （3）GC框：在更上游處，保守序列GGGCGG，與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合有關(guān) *RNA聚合酶III（轉(zhuǎn)錄5S RNA等）的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部,.,三、終止因子 1、終止因子（NusA）：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子，與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合（2NusA復(fù)合物），識(shí)別終止序

6、列。 2、 rho因子：具有核酸酶活力（水解三磷酸核苷）。在RNA聚合酶遇到終止子暫停作用時(shí)，解RNA-DNA螺旋，起解鏈酶作用。,.,四、終止子 1、終止子： 提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列 終止子可被RNA聚合酶或其輔助因子識(shí)別，但終止信號(hào)應(yīng)位于已轉(zhuǎn)錄的序列中 原核生物的終止子在終止點(diǎn)之前，有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA可形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使聚合酶停止移動(dòng)（p.465, 圖36-11）,.,不依賴r -因子的終止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列。,.,2、大腸桿菌的兩類終止子（p.465, 圖36-11） 不依賴于rho（）的終止子（簡(jiǎn)單終止子）：除能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，在終點(diǎn)前還有一系列

7、U（約6個(gè)），這個(gè)寡聚U序列可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。因?yàn)橛蓃U-dA組成的RNA-DNA雜交分子具有特別弱的堿基配對(duì)作用 依賴于rho（）的終止子：無(wú)寡聚U序列。必須在rho因子存在時(shí)才發(fā)生終止作用,.,第三節(jié) 轉(zhuǎn)錄過(guò)程,一 轉(zhuǎn)錄的起始 （一）原核生物的轉(zhuǎn)錄起始 RNA酶結(jié)合到DNA鏈上，DNA雙鏈部分解開形成轉(zhuǎn)錄空泡。原核生物由因子辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，原核生物在-35區(qū)有5-TTG ACA，在-10區(qū)有TAT AAT盒 轉(zhuǎn)錄起始不需引物, 5- PPPGPN-OH 第一個(gè)磷酸二酯鍵形成后, 亞單位即脫落下來(lái),.,RNA聚合酶與DNA模板鏈的結(jié)合,.,轉(zhuǎn)錄起始,.,(二)真核生物的轉(zhuǎn)

8、錄起始 順式作用元件(cis-acting element) -35區(qū) Hogness盒 (TATA盒) -40-110區(qū)CAAT盒GC盒 反式作用因子(trans-acting factor) 轉(zhuǎn)錄因子（） (三)轉(zhuǎn)錄因子和真核生物的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 、 起始前復(fù)合物（）,.,PIC,.,二 轉(zhuǎn)錄的延伸,原核生物和真核生物基本相同 亞基脫落，核心酶構(gòu)象改變，NusA結(jié)合 RNA的5 端伸展在轉(zhuǎn)錄空泡之外 模板為A，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相應(yīng)為U 原核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行,RNA鏈的延長(zhǎng),RNA鏈的延長(zhǎng),.,三 轉(zhuǎn)錄的終止 （一）原核生物轉(zhuǎn)錄終止的模式： 依賴因子(因子能與RNA結(jié)合，還具有ATP酶和解鏈

9、酶的活性) RNA 3形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 不依賴因子 終止區(qū)的堿基可形成特殊的結(jié)構(gòu) RNA 3形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和一串寡聚U （二） 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止 編碼鏈上存在轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)AATAAA 真核生物mRNA帶有polyA尾巴,.,依賴r -因子的終止子的終止反應(yīng)：,r -因子：含六聚體的寡聚蛋白，具有依賴RNA的NTP酶活性，它結(jié)合于新生RNA上，借助于水解NTP產(chǎn)生能量推動(dòng)RNA聚合酶向前移動(dòng)，當(dāng)酶遭遇終止子時(shí)暫停前進(jìn)， r -因子追上酶，與酶相互作用釋放RNA。因此，還具有RNA-DNA解螺旋酶活性。,.,不依賴r -因子的終止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列。,.,轉(zhuǎn)錄終止,.,.,轉(zhuǎn)錄的過(guò)

10、程,.,第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄后的修飾,一、原核生物rRNA前體的加工 結(jié)構(gòu)：每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由16S、23S、5S rRNA 以及一個(gè)或幾個(gè)tRNA基因所組成。,加工： RNAase：裂解產(chǎn)生16S和23S rRNA的前體（P16和P23） RNAaseE：裂解產(chǎn)生5S rRNA前體（P5） RNAaseM16和RNAaseM23：分別切除P16和P23兩端的互補(bǔ)序列 RNAaseM5：切除P5的兩端附加序列,.,二、原核生物tRNA前體的加工 結(jié)構(gòu)：tRNA基因大多成簇存在，或與rRNA、 mRNA基因組成混合轉(zhuǎn)錄單位。,加工： （1）由核酸內(nèi)切酶在tRNA兩端切斷： 5-核酸內(nèi)切酶（RNAaseP）：

11、在tRNA5端切開，是tRNA的5成熟酶 3-核酸內(nèi)切酶（RNAaseF）：在tRNA近3端處切開 （2）核酸外切酶（RNAaseD）：從前體3端逐個(gè)切去附加的序列，直至tRNA的3端，是tRNA的3成熟酶。,.,（3）在3端加上-CCAOH： -CCAOH結(jié)構(gòu)對(duì)接受氨?；幕钚允潜匾?的。 一類是本身具有CCA；另一類沒(méi)有，需要tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化逐個(gè)加上CCA。 （4）核苷的修飾：由特定的tRNA修飾酶催化，如假尿嘧啶核苷的糖苷鍵發(fā)生移位反應(yīng)（由尿嘧啶的N1變?yōu)镃5）。,三、原核生物mRNA前體的加工 一般不加工；少數(shù)多順?lè)醋觤RNA通過(guò)核酸內(nèi)切酶切成較小的單位，再行翻譯。,.,四、真

12、核生物rRNA前體的加工 1、結(jié)構(gòu)：由1618S、 2628S 和5.8SRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位 2、加工：由RNAase以及其他核酸內(nèi)切酶進(jìn)行加工 五、真核生物tRNA前體的加工 1、結(jié)構(gòu)：tRNA基因成簇排列 2、加工：核酸內(nèi)切酶和外切酶：切去tRNA前體5端和3端的附加序列 核苷酰轉(zhuǎn)移酶：在tRNA3端逐個(gè)加上CCA序列 修飾酶：tRNA特異成份的修飾,.,六、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 （一）首、尾的修飾 5-端帽結(jié)構(gòu)的形成(m7GpppG) O型帽子： m7G5ppp-5N1 型帽子： m7G5ppp5N1m2pN2p- II 型帽子： m7G5ppp5N1m2pN2m2p-

13、3-端 poly A尾巴的生成 由多聚腺苷酸聚合酶催化，以帶3- OH基的RNA為受體，ATP為供體， 在3端逐個(gè)加上A。 功能：保護(hù)mRNA。,.,SAM：S-腺苷甲硫氨酸,.,甲基化過(guò)程： G5ppp5N1pN2p-RNA+SAM m7 G5ppp5N1pN2p-RNA+S-腺苷高半胱氨酸 mRNA（鳥嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶 SAM=S-腺苷甲硫氨酸 m7 G5ppp5N1pN2p-RNA+SAM m7 G5ppp5N1m2pN2p-RNA+S-腺苷高半胱氨酸 mRNA（鳥嘌呤-2）甲基轉(zhuǎn)移酶 （核糖2-OH基上被甲基化） 帽子功能：翻譯過(guò)程中起識(shí)別和穩(wěn)定作用。,.,.,（二） 真核生物mR

14、NA前體的剪接,1、斷裂基因(split gene) 外顯子(exon) 內(nèi)含子(intron) 從中斷基因線性表達(dá)的方式分 翻譯前刪除內(nèi)含子 翻譯繞過(guò)內(nèi)含子 翻譯后刪除內(nèi)含子 2、內(nèi)含子定義擴(kuò)充 內(nèi)含子是隔斷基因線性表達(dá)的序列,.,3、內(nèi)含子的分類 按基因類型分 第一類內(nèi)含子：線粒體、葉綠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄初級(jí) rRNA基因，需要游離G發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)； 第二類內(nèi)含子：核、線粒體、葉綠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄初級(jí) mRNA基因； 套索狀剪接：SnRNA和SnRNP（核微小核糖核蛋白）完成； 第三類內(nèi)含子：tRNA基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的內(nèi)含子，為酶促拼接。,.,（1） Group I 內(nèi)含子拼接：rRNA前體的拼接（四膜蟲

15、） 結(jié)構(gòu)：rRNA前體為35S，其中26S rRNA基因中有一內(nèi)含子。 拼接： 第一步：鳥苷酸（G）的3-OH攻擊內(nèi)含子的5末端磷酸基，使內(nèi)含子的5末端磷酸基轉(zhuǎn)移到G的3-OH上，也就使內(nèi)含子5末端斷開； 第二步：第一個(gè)外顯子產(chǎn)生的3-羥基攻擊第二個(gè)外顯子5末端的磷酸基，使第二外顯子的5末端磷酸基轉(zhuǎn)移到第一外顯子3-OH上。這樣使內(nèi)含子切下，外顯子連接； 第三步：切下的內(nèi)含子3-OH攻擊自身5末端附近（第15個(gè)核苷酸處）的磷酸基，形成一個(gè)環(huán)狀分子。 這是類型I自我拼接：無(wú)需酶的參與，需要游離鳥苷酸發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，自我催化拼接。,.,rRNA前體的拼接,.,核酶（ribozyme）-具有催化活性的

16、RNA 1982 T.R. Cech 四膜蟲 rRNA前體 1983 S.Altman RNase P對(duì)tRNA前體加工 錘頭狀核酶，發(fā)夾狀核酶 人工核酶 (抗感染，抗腫瘤),.,（2） Group II 內(nèi)含子拼接：套索剪切模式 結(jié)構(gòu)：內(nèi)含子左端（供體）均為GU，右端（受體）均為AG，這稱GT-AG規(guī)律。 拼接： 第一步：在內(nèi)含子左端切開，產(chǎn)生的內(nèi)含子5末端磷酸基與其3端上游30核苷酸附近的CUGAC序列中的A（2-OH）形成5,2-磷酸二酯鍵，即套索結(jié)構(gòu)； 第二步：內(nèi)含子的右端切開，產(chǎn)生右側(cè)外顯子5-磷酸基；然后左側(cè)外顯子3-OH攻擊右側(cè)外顯子的5-磷酸基，兩個(gè)外顯子形成磷酸二酯鍵而連接在

17、一起； 第三步：套索狀內(nèi)含子去分支而成線狀分子。,.,mRNA前體的拼接,CUGAC,.,hnRNA 的剪接 套索剪切模式 (hnRNA mRNA) 內(nèi)含子有 5 GUAG 3 5GU U1-snRNA 結(jié)合（snRNP） 3AG 分支點(diǎn) A U2-snRNA 結(jié)合（snRNP） U1-snRNA, U2-snRNA等形成并接體將內(nèi)含子切除 snRNA 300個(gè)核苷酸組成 與核內(nèi)蛋白質(zhì)（U族）組成snRNP（核微小核糖核蛋白） 與內(nèi)含子的剪切有關(guān) 這是核mRNA的拼接體拼接：需要多種蛋白（snRNP）參與拼接。,.,.,.,（3） Group III 內(nèi)含子拼接：tRNA前體的拼接（酵母） 結(jié)

18、構(gòu)：內(nèi)含子插在靠近反密碼子處，部分與反密碼子堿基配對(duì)，這樣反密碼子環(huán)不存在，只有內(nèi)含子構(gòu)成的環(huán)。,.,.,拼接： 第一步：特異的內(nèi)切酶切下內(nèi)含子 左側(cè)tRNA半分子成2,3-環(huán)狀磷酸基和右側(cè)tRNA半分子成5-羥基；內(nèi)含子5端為羥基，3端為2,3-環(huán)狀磷酸基； 第二步：在激酶和ATP作用下右側(cè)tRNA半分子的5-羥基轉(zhuǎn)變成5-磷酸基 在環(huán)磷酸二酯酶作用下左側(cè)tRNA半分子的2,3-環(huán)狀磷酸基被打開而形成2-磷酸基和3-羥基 連接酶被ATP活化成腺苷酸化酶連接酶將AMP轉(zhuǎn)移到右側(cè)tRNA半分子的5-磷酸基上 左側(cè)tRNA半分子的3-羥基攻擊右側(cè)tRNA半分子的-磷酸基 AMP被取代而產(chǎn)生5,3-磷酸二酯鍵 切除2-磷酸基。 這是核tRNA的酶促拼接（第三類內(nèi)含子）。,.,本章重點(diǎn),掌握模板鏈、編碼鏈、不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄的概念。 掌握斷裂基因、外顯子，內(nèi)含子概念。 熟悉真核生物，mRNA、tRNA及rRNA轉(zhuǎn)錄后加工的