《酶工程實(shí)驗(yàn)》教案

1、學(xué)習(xí)好資料歡迎下載徐州工程學(xué)院教案2013年至 2014年 第 1 學(xué)期 第 周 星期課題名稱（含教材章節(jié)）：酶工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一產(chǎn)纖維素酶菌株篩選和產(chǎn)酶條件優(yōu)化分析教學(xué)目的和要求：1、熟悉功能性菌株篩選方法2、掌握纖維素降解菌株的篩選方法3、掌握菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化方法教學(xué)重點(diǎn)：酶工程研究開(kāi)發(fā)的策略教學(xué)難點(diǎn)：產(chǎn)酶條件優(yōu)化方法教學(xué)內(nèi)容（要 點(diǎn)）1、產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選分析2、菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化學(xué)習(xí)好資料歡迎下載徐州工程學(xué)院教案紙一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉功能性菌株篩選方法2、掌握纖維素降解菌株的篩選方法3、掌握菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化方法二、實(shí)驗(yàn)原理(一)、功能性菌株開(kāi)發(fā)策略 1應(yīng)用微生物來(lái)開(kāi)發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)(1) 微生物生

2、長(zhǎng)繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來(lái)生產(chǎn)酶產(chǎn)品， 生產(chǎn)能力(發(fā)酵)幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場(chǎng)需 求。(2) 微生物種類繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不同的 環(huán)境下生存的微生物都有其完全不冋的代謝方式，能分解利用不冋的底物。(3) 為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。(4) 當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在地酶，幾乎都能夠利用微生 物細(xì)胞獲得。因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎 任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞。2、微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(一) 樣品的采集采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量。(二) 菌種的分離培養(yǎng)基的確疋、培養(yǎng)條件的確疋

3、。(三) 菌種的初篩(1) 用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩；(2) 在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株 得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化 分離。(四) 菌種的復(fù)篩初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩 選產(chǎn)酶量咼、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。復(fù)篩。酶活的測(cè)定方法的建立尤其重要。(五) 對(duì)復(fù)篩獲得菌株的要求(1) 不是致病菌；(2) 菌株不易變易和退化；(3) 不易感染噬菌體；(4) 微生物產(chǎn)酶量高；(5) 酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞外酶；(6) 產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高；(7) 微生物培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低。(六) 最佳產(chǎn)

4、酶條件的初步確定(1) 培養(yǎng)方式的確定；(2) 最佳培養(yǎng)條件組合；(3) 微生物產(chǎn)酶的特性(胞內(nèi)酶、胞外酶)；學(xué)習(xí)好資料歡迎下載(4)微生物酶收集的時(shí)間順序；(七)微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提咼(1) 獲得咼產(chǎn)菌種的突變體；(2) 利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來(lái)提高微生物的酶產(chǎn)量；(3) 運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到 另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)，使其咼效表達(dá)；(八)微生物酶的提取方法(1)酶的粗提；(2)酶的精制。(九)微生物產(chǎn)酶菌種的保藏(1) 斜面；(2) 沙土管；(3) 冷凍。普通冷凍保藏技術(shù)(-20 C )超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60 -80 C)液

5、氮冷凍保藏技術(shù)(二)、纖維素酶研究情況2.1纖維素酶簡(jiǎn)介2.1.1 纖維素纖維素占植物干重的 35%50%是地球上分布最廣的碳水化合物。它 無(wú)色、無(wú)味，呈白色絲狀，不溶于水及一般的有機(jī)溶劑。纖維素分子 是由葡萄糖苷通過(guò)3 -1,4糖苷鍵連接起來(lái)的鏈狀高分子，分子量 500002500000,相當(dāng)于30015000個(gè)葡萄糖基，不形成螺旋構(gòu)象，沒(méi)有分支結(jié)構(gòu)，易形成晶體。2.1.2纖維素酶纖維素酶是能將纖維素水解成還原糖的一類酶系的總稱。目前普遍認(rèn) 為要完全降解纖維素，至少需要3種功能不同的酶協(xié)同作用。它們是EG(內(nèi)切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和CB( 3 -葡萄糖苷酶)。2.2纖維素酶的應(yīng)

6、用2.2.1在能源方面的應(yīng)用乙醇是一種可以通過(guò)糖發(fā)酵獲得的可再生能源。在美國(guó)，乙醇已經(jīng)被 廣泛地作為石油燃料的替代品。從上世紀(jì)80年代開(kāi)始，用玉米生產(chǎn)的燃料乙醇就被作為酒精-汽油混合燃料或者氧化燃料來(lái)使用。這些混合燃料中乙醇的體積比例高達(dá)10%使用乙醇混合燃料可以降低石油燃料的使用量，從而在一定程度上減少了溫室氣體的排放。然而使用玉 米生產(chǎn)的乙醇燃料比石油燃料成本咼，因?yàn)樽鳛橐环N作物，玉米需要 一定的培植時(shí)間和成本；同時(shí)，玉米本身是一種食物和飼料，大量地 用于生產(chǎn)乙醇是不可行的，畢竟耕地資源有限。廢棄纖維素原料比如 農(nóng)林廢棄物、早、鋸末和木片等是生產(chǎn)乙醇的潛在的而充足的可再生性資源。利用纖維素

7、酶有效地將這些纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖等單糖， 然后通過(guò)微生物發(fā)酵的方法將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇，將為乙醇混合燃料 的生產(chǎn)與應(yīng)用打開(kāi)一片新天地。開(kāi)發(fā)利用這一可再生資源的關(guān)鍵是纖維素物質(zhì)的預(yù)處理以和如何使纖 維素酶在水解過(guò)程中酶活性最大地發(fā)揮。預(yù)處理可以去除木質(zhì)素和半 纖維素，在一定程度上降低纖維素的結(jié)晶度并且增加纖維素物質(zhì)的可 接觸面積。至于纖維素酶，為了滿足競(jìng)爭(zhēng)的需要，生產(chǎn)每加侖乙醇的 纖維素酶的成本不能過(guò)高。這樣就要求盡量降低纖維素酶系統(tǒng)的復(fù)雜 度，只保留少量幾種必須組分；更重要的是生產(chǎn)出能夠更有效地水解 預(yù)處理過(guò)的纖維素物質(zhì)的重組型纖維素酶。2.2.2在其他方面的應(yīng)用纖維素酶已被廣泛的應(yīng)用于食品

8、、釀造、農(nóng)業(yè)、紡織、洗衣等多個(gè)領(lǐng) 域中。食品工業(yè)中利用纖維素酶處理植物性原料，可使植物細(xì)胞壁軟化、崩 潰，從而改變細(xì)胞壁的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)含物如蛋白質(zhì)、糖等的釋 放與提取，便于加工。另外，在過(guò)去果實(shí)和蔬菜的加工過(guò)程中，軟化 植物組織的辦法主要采用熱燙或者酸堿處理，使得果蔬的香味和維生 素大量損失，使產(chǎn)品的食用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降。現(xiàn)在利用纖維素酶進(jìn)行 預(yù)處理就可以避免這些缺點(diǎn)。醬油釀造主要利用蛋白酶、淀粉酶等酶類對(duì)原料進(jìn)行酶解，若再使用纖 維素酶，使大豆等原料的細(xì)胞膜膨脹軟化破壞，使包藏在細(xì)胞中的蛋 白質(zhì)、碳水化合物釋放，這樣就可以縮短釀造的時(shí)間、提高產(chǎn)率，同時(shí)還提高品質(zhì)，使氨基酸還原糖含量增加。

9、在啤酒、葡萄酒的釀造過(guò)程中也使用到纖維素酶。在低質(zhì)量大麥發(fā)芽 的過(guò)程中加入纖維素酶可水解3 -1,3和B -1,4葡聚糖從而幫助大麥發(fā)芽。纖維素酶還可以提高啤酒的過(guò)濾效率，并能增加葡萄酒的香味。由于畜禽飼料中含有大量的纖維素，除某些反芻動(dòng)物有分解纖維素的 能力外，大部分畜禽沒(méi)有此能力。纖維素酶能夠分解復(fù)雜的纖維素， 生成易消化物質(zhì)葡萄糖，便于動(dòng)物吸收。在飼料中添加了纖維素酶后， 其提高家畜家禽生長(zhǎng)性能、生產(chǎn)性能等效果顯著。纖維素酶已成為紡織和洗衣行業(yè)的第三大酶系。生物打磨和生物拋光 是目前纖維素酶在紡織行業(yè)中的主要應(yīng)用。纖維素酶也被用于家用洗 滌劑中，因?yàn)樗鼈兛梢栽黾尤ノ勰芰Γ瑥目椢锉砻嫒ヌ幮?/p>

10、的碎纖維， 增加織物表面的亮度和光澤。2.2.3纖維素酶應(yīng)用中存在的問(wèn)題纖維素酶作為能夠有效降解纖維素的酶類，無(wú)論在動(dòng)物生產(chǎn)還是環(huán)境 保護(hù)中都確實(shí)起到了一定的作用，有非常好的應(yīng)用前景。但是纖維素 酶在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中很大程度上受到其活性和成本的限制。目前，對(duì)于纖維素酶的研究也仍然存在菌株產(chǎn)酶效率低、生產(chǎn)成本咼、作用于動(dòng)物的機(jī)理尚未完全清楚等問(wèn)題，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約著纖維素 酶的推廣應(yīng)用。纖維素酶的基因克隆為研究纖維素酶的生物合成和作用機(jī)制，以及了 解纖維素酶遺傳特性進(jìn)而構(gòu)建高效纖維素分解菌開(kāi)辟了新的途徑。國(guó) 內(nèi)外已開(kāi)展了大量的相關(guān)研究，隨著研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，也取得了一 定的新進(jìn)展。隨著生物

11、技術(shù)的發(fā)展和酶應(yīng)用技術(shù)研究的深入，纖維素 酶一定會(huì)在各類大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中大放異彩。2.3產(chǎn)纖維素酶菌株的研究進(jìn)展自然界中存在著諸多天然的產(chǎn)纖維素酶的菌株，所以對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌 株的選育也是研究纖維素酶的一個(gè)熱點(diǎn)。產(chǎn)纖維素酶的菌株主要可以 分為以下幾類：1) 真菌類：絲狀真菌是目前研究最多的纖維素降解類群，該類微生物能產(chǎn)生大量 的纖維素酶，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬和漆斑 霉屬。其中尤以木霉屬的產(chǎn)量居上，里氏木霉(Trichoderma ressiei )、康氏木霉(Trichoderma koniggii )、擬康氏木霉 (Trichoderma pseudokoniggii

12、)、綠色木霉(Trichoderma viride )、黑曲霉 (Aspergillus niger)等是其中活性較咼的代表菌種。2) 細(xì)菌類：產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌類，目前研究較多的是纖維粘菌屬、生孢纖維粘菌 屬、纖維桿菌和芽孢桿菌屬，代表菌種有熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum )、嗜酸纖維分解菌(Acidathermus Celluloluticus)、Cellulomonas fimi 、 Pseud-omonasfluorescens subsp 、Thermo mon osprafusca等。細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的量較少，主要是內(nèi)切 葡聚糖酶，一般不分泌到胞外，而是處于

13、細(xì)胞壁“固定化”的狀態(tài)， 可在細(xì)胞壁上形成一種突起物。3) 其他類：放線菌中產(chǎn)量稍高的主要是黑紅旋絲放線菌(Actinomycesmelanocyclus )、玫瑰色放線菌 (Actinomyces rose odiastaticu )和纖維放線菌(Actinomycescellulos )等，分枝桿菌和原 放線菌幾乎不產(chǎn)纖維索酶或產(chǎn)量極低。酵母雖然很少產(chǎn)纖維索酶，但 可以利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)纖維索酶基因，其產(chǎn)物高度糖基化，經(jīng)正 確加工修飾后直接接分泌到培養(yǎng)基，表達(dá)水平咼，并具有正常的生物 學(xué)活性。也有利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)纖維索酶基因，但是纖維索酶 在E. coli中的表達(dá)分泌水平很低

14、，而且提取有很大困難，所以目前 應(yīng)用較少。瘤胃微生物的遺傳改造也已引起了人們的廣泛注意，利用DNA重組技術(shù)提高反芻動(dòng)物瘤胃中纖維素轉(zhuǎn)化率，可以大幅度降低飼料用量，帶 來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。近幾年來(lái)，瘤胃微生物遺傳改造的研究已取得較 大進(jìn)展。瘤胃細(xì)菌，如 Butyricibrio fibrisolce ns的載、受體系統(tǒng)已基本建立；來(lái)自 Bacteroides Succinogenes 禾口 Butyrivibrio sp 的 某些纖維素酶基因已相繼被克隆，目前存在的主要問(wèn)題是瘤胃中微生 物種類繁多，各類微生物生長(zhǎng)速度隨環(huán)境不冋而變化，在瘤胃中滯留 時(shí)間短，難以建立起穩(wěn)定的工程菌。（三）、本實(shí)驗(yàn)總體

15、步驟1、產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選分析要求：（1）熟悉功能性菌株篩選步驟。（2）掌握產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選方法2、菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化要求：（1）掌握葡萄糖內(nèi)切酶活性分析方法。（2）掌握產(chǎn)酶條件優(yōu)化方法。三、實(shí)驗(yàn)材料酵母粉、蛋白胨、瓊脂，羧甲基纖維素，匍萄糖，Na2HPO4, NaH2PO4，大腸桿菌，冰，1ml、2ml、5ml塑料離心管，燒杯，移液器，超聲波破碎儀。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、培養(yǎng)基的配置1、1 LLB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g,酵母粉 5 g, NaCl 10 g。每L LB固體培養(yǎng)基還需加瓊脂粉12 g。2、 1 L產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素10

16、g，蛋白胨10 g,酵 母粉10 g, KH2PO4 1 g, NaCl 5 g，葡萄糖2 g,瓊脂12 g,滅菌備用。（二八咼壓火菌1、首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相 平為宜；2、放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品，注意不要裝得太緊，以免妨礙蒸汽流 通而影響火菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水 淋濕包口的紙而透入棉塞；3、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，再以兩兩對(duì)稱的方 式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺絲，使螺絲松緊一致，勿使漏氣；4、插上電源，加熱，并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣， 待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度

17、隨蒸汽壓力增加而逐漸 上升，當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力到所需時(shí)間，本 實(shí)驗(yàn)用0.1 MPa, 121.5 C, 20分鐘滅菌，滅菌的主要因素是溫度而不是壓 力，因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力；5、火菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓火菌鍋內(nèi)的溫度自然下降，當(dāng)壓力表 的壓力降至“ 0”時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品；6、 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37 C溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌 生長(zhǎng)，即可待用。（三）、產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選將菌株轉(zhuǎn)接到產(chǎn)纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基，在溫箱中培養(yǎng)2-4d，然后將0.5%的剛果紅倒入培養(yǎng)基中染色5mi

18、n，倒掉剛果紅后，使用 5%的NaCI溶液浸泡脫色1h。若菌株周圍有透明水解圈出現(xiàn)，則說(shuō)明該菌株產(chǎn)纖維素 酶。纖維素酶可以將培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素水解為小分子量的低聚糖、 二糖或單糖，剛果紅與羧甲基纖維素結(jié)合后顯紅色，而與小分子量糖類結(jié) 合不顯紅色，因此產(chǎn)纖維素酶菌株周圍出現(xiàn)透明水解圈。對(duì)初篩到的菌株 進(jìn)行劃單菌落復(fù)篩。改變溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量透明水解 圈與菌落直徑的比值初步確定產(chǎn)纖維素酶活性咼的菌株。（四）、菌株保藏將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡(jiǎn)便，但需置 備低溫冰箱。保藏溫度若米用 -20 C,保藏期約為0.51年，而米用-70 C, 保臧期可達(dá)10年。本

19、實(shí)驗(yàn)中米用的-79 C進(jìn)行保臧菌種。取菌種保藏管，標(biāo)上號(hào)，倒入50%的甘油（121 C蒸汽滅菌20min ）和50%的菌液（對(duì)號(hào)），上下顛倒，混勻，放入-79 C冰箱中。五、作業(yè)1、將篩選菌株結(jié)果照片粘貼上，并分析篩選結(jié)果。2、總結(jié)產(chǎn)纖維素酶菌株篩選的注意事項(xiàng)。學(xué)習(xí)好資料歡迎下載徐州工程學(xué)院教案2013年至 2014年第_J_學(xué)期第周 星期課題名稱（含教材章節(jié)）：酶工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二產(chǎn)酶菌株酶基因克隆分析教學(xué)目的和要求：1、掌握根據(jù)保守性序列設(shè)計(jì)引物方法。2、使用PCR方法擴(kuò)增相關(guān)酶基因，測(cè)序，分析序列特征。教學(xué)重點(diǎn)：酶基因克隆的策略教學(xué)難點(diǎn)：序列分析軟件的使用方法教學(xué)內(nèi)容（要 點(diǎn)）1、纖維素酶基

20、因引物設(shè)計(jì)和克隆2、纖維素酶基因序列分析學(xué)習(xí)好資料歡迎下載徐州工程學(xué)院教案紙一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握根據(jù)保守性序列設(shè)計(jì)引物方法。2、使用PCR方法擴(kuò)增相關(guān)酶基因，測(cè)序，分析序列特征。3、掌握分子酶工程的基本技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理通過(guò)人工操作，獲得人們所需的酶，并通過(guò)各種方法使酶發(fā)揮其催化 功能。新型酶開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方法是克隆新的酶基因，通過(guò)重組表達(dá)，獲 得功能性酶蛋白，并加以改造和工業(yè)化應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)保守性序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增獲得纖維素酶基因，以瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，分析擴(kuò)增結(jié)果，送生物公司進(jìn)行測(cè)序，再 利用生物信息學(xué)軟件分析酶的序列特征。三、實(shí)驗(yàn)材料PCR引物、硼酸、瓊脂糖，羧甲基纖維素

21、，葡萄糖，Na2HPO4, NaH2PO4, 大腸桿菌，冰，1ml、2ml、5ml塑料離心管，燒杯，水平電泳儀，凝膠成像 觀察儀、微量移液器。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、菌株基因組DNA的提取提取各菌株基因組 DNA，作為PCR反應(yīng)模板刃1、 按1%的接種量接種細(xì)菌到裝有5 ml LB培養(yǎng)基的試管中， 30C 150r/m振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使其長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。次日取 1 ml菌液于1.5 ml離 心管，10, 000Xg離心1min沉淀菌液。2、 棄上清，加 1 mlO.9%NaCI將沉淀重懸浮，10, 000 X離心3min。3、 棄上清，加450微升水，重懸浮，加 50微升20%SDS,輕輕多次吹 打，并上下顛倒離心管，使沉淀混勻，75 C水浴5min（直至菌液裂解為澄清）。4、 加500微升3:1的酚比氯仿抽提蛋白質(zhì)，輕輕（防止破壞DNA鏈） 上下顛倒使之混勻，10, 000Xg離心5 min。5、輕輕吸取上清于一新的 1.5 ml離心管（注意不要吸到中間的蛋白質(zhì)）并補(bǔ)足體積到 50