微生物研究法D組(課堂PPT)

1、1,微生物研究法D組,報(bào)告者：曾仁志 報(bào)告日期：2005/9/19,題目：(1)CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對(duì)培養(yǎng)基pH值的調(diào)控。 (2)成立一個(gè)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室需要什麼需求。,2,培養(yǎng)基pH值的變動(dòng)對(duì)細(xì)胞造成的影響,哺乳動(dòng)物細(xì)胞最適生長的pH範(fàn)圍為7.27.4，過酸或過鹼都會(huì)對(duì)細(xì)胞生長不良或造成傷害，故讓培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定是相當(dāng)重要。 For example： Articular Chondrocytes(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)，主要的能量來源是透過糖解作用之無氧代謝，Pyruvate轉(zhuǎn)換成 lactic acid，會(huì)迅速酸化培養(yǎng)基而導(dǎo)致抑制細(xì)胞生理及代謝。,

2、Glucose,Glycolysis,Glucose-6-phosphate,Pyruvate,Lactic acid,pH,Cell,3,CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對(duì)培養(yǎng)基pH值的調(diào)控,培養(yǎng)基的pH buffer system最常用NaHCO3加入培養(yǎng)基中，以CO2來調(diào)整pH在適當(dāng)之範(fàn)圍 (HCO3- + H+ H2CO3 CO2 + H2O)。 細(xì)胞生長需要CO2的環(huán)境，然而在CO2 incubator不斷的補(bǔ)充CO2下，培養(yǎng)基會(huì)越來越酸。加sodium bicarbonate進(jìn)去，使HCO3- 去抓住H+ 來平衡pH值。然而在細(xì)胞生長快速及c

3、arbonic anhydrase的存在下，培養(yǎng)基會(huì)酸化的更快，故以添加HEPES來穩(wěn)固細(xì)胞生長最適之pH的環(huán)境。,4,CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對(duì)培養(yǎng)基pH值的調(diào)控,5,以HEPES當(dāng)培養(yǎng)基之緩衝液之優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞毒性較小，適用於多種類型細(xì)胞的培養(yǎng)。(參見表一),盡可能避免光照,缺點(diǎn)：長期暴露於光照下，會(huì)產(chǎn)生具細(xì)胞毒性之自由基。(但是只要避光保存便可避免，此問題較易解決。),6,參考資料,表一、各種常用緩衝液及其使用範(fàn)圍,7,Phosphate buffer with or without Ca2+,Phosphate buffer wit

4、hout Ca2+： 多應(yīng)用於細(xì)胞培養(yǎng)之沖洗。 With or without Ca2+ ? Why ?,8,Phosphate buffer with or without Ca2+,Phosphate buffer與鈣離子結(jié)合沉澱的原因： 溶液的pH值 在溶液中，磷酸鹽是以三價(jià)的磷酸根（PO43-）、二價(jià)的磷酸氫根（HPO42-）和一價(jià)的磷酸二氫根（H2PO4-）存在，這三個(gè)離子會(huì)維持一個(gè)平衡的狀態(tài)，但是PO43-要在強(qiáng)鹼（pH值很大時(shí)）的情況下才會(huì)存在，所以在phosphate buffer溶液中只可能以HPO42-及H2PO4-存在。 HPO42-較會(huì)和鈣離子產(chǎn)生沉澱。在pH值7.4時(shí)

5、會(huì)有80%的HPO42-存在，較會(huì)和鈣離子產(chǎn)生沉澱；若pH值下降至5.4時(shí)，則有96%的H2PO4-的存在，這樣一來就減少產(chǎn)生磷酸鈣沉澱的機(jī)會(huì)。所以溶液pH值影響鈣磷沉澱很大，pH值較低時(shí)，發(fā)生沉澱的機(jī)會(huì)也較低。,9,Phosphate buffer with or without Ca2+,10,成立一個(gè)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本需求,設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本考量 細(xì)胞培養(yǎng)最害怕的就是污染的問題，因此提供一個(gè)無菌的設(shè)備、環(huán)境及無菌操作技術(shù)是十分重要的。,UV殺菌燈,11,設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本考量,無菌操作臺(tái),滅菌器,12,設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本考量,細(xì)胞培養(yǎng)室與其他工作室隔離，需有23道門，要有緩衝區(qū)來更

6、換鞋子與實(shí)驗(yàn)衣。,Air shower,13,設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本考量,細(xì)胞培養(yǎng)箱、冰箱、桌上型離心機(jī)、顯微鏡等設(shè)備 。,Incubator,冰箱,14,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本配備,離心機(jī),顯微鏡,15,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之基本配備,其他設(shè)備 1.水浴槽 2.液態(tài)氮 3.-20 、-80 、4 等冰箱。 4.其他的視實(shí)驗(yàn)需求而定。,16,參考文獻(xiàn),Fisk A., Pathak S., (1969) HEPES-buffered medium for organ culture. Nature. 224, 1030-1031. Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.A., (2004) Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accumulation, and morp