刀豆素a誘發(fā)小鼠急性肝損害模型的形態(tài)改變及fas和fasl的表達(dá).

1、刀豆素 a 誘發(fā)小鼠急性肝損害模型的形態(tài)改變及 fas 和 fasl 的表達(dá)材料和方法一、實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性balb/c小鼠，812周，體重2027 g，第二軍醫(yī) 大學(xué)動(dòng)物中心提供。（ 二） 主要試劑 con a: 美國(guó) sigma 公司；兔抗鼠 fas 單抗及 fasl 單抗： 美國(guó) santa cruz 公司；羊抗兔 igg ：上海醫(yī)學(xué)化學(xué)檢驗(yàn)所； lsab 試劑盒：丹麥 dako 公司提供。二、實(shí)驗(yàn)方法（一）小鼠急性肝損害模型的建立 將balb/c小鼠隨機(jī)分成五組，a組（對(duì) 照組）以0.25 ml注射用生理鹽水代替，b、c、d、e組分別以每公斤體重10 40 mg con a

2、的劑量，以 0.25 ml 生理鹽水充分溶解后尾靜脈一次性注入， 8 h 后摘眼球放血，以 2 500 r/min 離心 20 min 后取血清待檢，臟器用中性緩沖福 爾馬林液固定。（ 二 ） 組織病理學(xué)檢查 1. 肝臟等組織普通病理：常規(guī) he 染色，對(duì) a、b、 d 三組用病理指標(biāo)評(píng)定肝損程度，病理指數(shù)的確定：在高倍鏡下每次取 20 個(gè)視野，每一視野分三等份；“ 0”記整個(gè)視野無(wú)肝細(xì)胞病變；“ 1”記肝細(xì)胞 發(fā)生病變1/3視野；“2”記肝細(xì)胞發(fā)生病變 1/32/3 視野；“ 3”記肝細(xì)胞 發(fā)生病變2/3視野；20個(gè)視野得分相加即為肝細(xì)胞的病理指數(shù) pi 值。2.鏈酶 親合素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化

3、物酶顯色法 （s-p 法）觀察肝組織 fas 及 fasl 表達(dá)：（1） 肝組織 fas 表達(dá)：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，充分洗滌，微波抗原修復(fù)后冷 卻至室溫，以 lsab 試劑盒免疫組化檢測(cè)，按說(shuō)明操作。依次用正常兔血清 （阻 斷）、兔抗鼠 fas 單抗（反應(yīng)） 、生物素羊抗兔 igg（ 連接） 、過(guò)氧化物酶 -鏈酶親 合素反應(yīng)，二氨基聯(lián)苯胺 （dab） 顯色后，蘇木素襯染。 （2） 肝內(nèi) fasl 的表達(dá)檢 查：與檢測(cè) fas 相同的免疫組織化學(xué)技術(shù)，改用兔抗鼠 fasl 單抗，以氨基乙基 咔唑顯色。 （3） 實(shí)驗(yàn)對(duì)照：陰性對(duì)照：用 pbs 替代第一抗體設(shè)空白對(duì)照；用正 常兔血清替代第一抗

4、體設(shè)替代對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：用已知表達(dá) fas 及 fasl 的淋巴 結(jié)為對(duì)照。 （4） 結(jié)果判定：陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，分布于胞膜和胞漿中，胞核經(jīng)蘇 木素襯染為淡藍(lán)色。（ 三） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （alt） 測(cè)定 賴氏法。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t 檢驗(yàn)， f 檢驗(yàn)，相關(guān)分析。結(jié)果一、不同劑量 con a 作用 8 h 后 alt 表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)中觀察到 con a 30 mg/kg 及 40 mg/kg 用量組在用藥后 6 h 左右出 現(xiàn)少動(dòng)，抓之無(wú)反抗，肢體逐步發(fā)涼，放出的血，血凝塊收縮不良等， d 組在 7 h 死亡 1 只。各組測(cè)定的 alt 結(jié)果如表 1 所示。以 con a 劑量為變量，以 alt 為

5、應(yīng)變量的相關(guān)分析顯示兩者呈顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r=0.59（p=0.002） ， 說(shuō)明肝功能的損害對(duì) con a 具有劑量依賴性。二、組織病理學(xué)觀察（ 一） he 染色 心、肺、肝、腎、脾等臟器 he 染色結(jié)果顯示只有肝組織有 明顯的損害。不同程度地表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝細(xì)胞腫脹、變性，肝竇 及中央小靜脈淤血，部分肝細(xì)胞內(nèi)有大的脂肪空泡形成，胞漿透亮，核固縮， 小灶性壞死多見(jiàn)，肝內(nèi)小血管中可見(jiàn)到較多的炎性細(xì)胞集聚。此外，單個(gè)肝細(xì) 胞嗜酸性變非常普遍。用病理指數(shù)作為肝損的量化指標(biāo)，b、d 組分別為：41.5 9.2、45.5 7.8，隨著con a劑量的加大，pi有上升趨勢(shì)，與對(duì)照a組

6、10 4.2 差異有顯著及非常顯著性。表 1 不同劑量 con a 處理后小鼠血清 alt 表在水平 組別 con a 量(mg/kg)實(shí)驗(yàn)只數(shù) 死亡數(shù) alt(u/l) a 0 6 0 62 19b 10 6 0 1 405 807*c 20 6 0 3 182 1 494*d 30 7 1 8 933 4 076*e 40 7 0 10 229 9 071*注：alt 值為土 s *p0.01（ 二） 免疫組織化學(xué) fas 在對(duì)照組和 con a 處理組肝細(xì)胞表面及肝竇內(nèi)皮 細(xì)胞表面均有表達(dá)，但 con a 處理組比較顯著 ;fasl 只表達(dá)于 con a 處理組肝 組織中，靠近中央靜脈的

7、肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯。討論con a 在體外能刺激 t 細(xì)胞分裂并釋放各種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性是其生物學(xué)特性之一。本實(shí)驗(yàn)在無(wú)需致敏的情況下用尾靜脈 一次性注射一定劑量 con a 的方法成功地建立了純種 balb/c 小鼠特異性肝損害 模型。通過(guò) con a 注射劑量與血清 alt 表達(dá)水平的相關(guān)分析及病理指數(shù)的觀 察，提示在一定范圍內(nèi)肝損程度與 con a 劑量有顯著的正相關(guān)。通過(guò)對(duì) con a 處理組 balb/c 小鼠主要臟器的病理觀察顯示，只有肝組織有 明顯的損害，不同程度地表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、變性，壞死，肝內(nèi)小血管中可見(jiàn) 到較多的炎性細(xì)胞集聚。此外，單個(gè)肝細(xì)胞嗜酸性

8、變非常普遍。免疫組織化學(xué) 檢查顯示 fas 在對(duì)照組的 balb/c 小鼠肝組織中有表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，而 con a 處理組肝組織中 fas 表達(dá)尤為明顯，在肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮表面多見(jiàn)。 fasl 只表達(dá)于 con a 處理組肝組織中，靠近中央靜脈的肝細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽(yáng)性。con a 誘導(dǎo)特異性肝臟損害的原因尚不清楚。 gantner 等 3觀察到 cona只聚集在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面。con a對(duì)肝臟的特異性損害尚取決于t淋巴細(xì)胞 的激活，并依賴于與巨噬細(xì)胞的互相作用。電鏡還觀察到淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞緊 密接觸的現(xiàn)象4。keren等5認(rèn)為con a可能起到替代抗原提呈細(xì)胞提 呈的mhc-ii類分子結(jié)合

9、的多肽抗原的作用。近年的研究認(rèn)為，肝臟的結(jié)構(gòu)特異 性-肝細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞的緊密接觸，使其實(shí)質(zhì)細(xì)胞與免疫細(xì)胞不必通過(guò)體液循 環(huán)而相互作用，這可能增加了作用的直接性和強(qiáng)度而較別的臟器更容易遭受免 疫攻擊。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是con a毒性的靶細(xì)胞，con a在體內(nèi)可能亦能通過(guò)誘導(dǎo)t細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步分泌某些細(xì)胞因子發(fā) 揮作用。此外，小鼠的淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞廣泛地分布著 fas 6，而活化的t淋巴細(xì)胞，尤其是cd + 8ctl細(xì)胞及cd + 4th1 亞群可表達(dá)fasl 7，因而con a可能通過(guò)激活t淋巴細(xì)胞表達(dá)fasl,以可溶 性fasl的形式誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。既往認(rèn)為只有成熟t細(xì)胞表達(dá)fasl o galle等8首次在酒精性肝病肝細(xì)胞表面檢測(cè)到fasl，并提出了“細(xì)胞自殺”及“同胞相殺”的假設(shè)。本實(shí)驗(yàn)初步觀察到con a處理組肝細(xì)胞內(nèi)有fasl表達(dá)，提示表達(dá)fasl的肝細(xì)胞可能充當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞，引起“細(xì)胞自殺”及“同胞相殺” 的可能。刀豆素a(concanavalin a, con a)在體外可刺激t細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，并釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)