illumina SNP 分析技術(shù)方案書.doc

1、 編號(hào): jn-20110912 illumina snp 分析技術(shù)方案書晶能生物技術(shù)（上海）有限公司二0一一年九月十二日公司背景illumina公司是一家從事開發(fā)，制造及銷售用于分析遺傳變異和生物功能的綜合系統(tǒng)的高科技公司，于1998年成立，2005年進(jìn)入中國，2007和2009年兩次入選福布斯雜志評(píng)出的全美年度成長速度最快的高科技公司，同時(shí)亞太地區(qū)是illumina全球增長最快的區(qū)域。公司在福布斯所公布的2009年度成長最快的高科技公司中超越google，位列榜首。illumina的業(yè)務(wù)范圍包括生物芯片技術(shù)，和新一代高通量測序技術(shù)兩大領(lǐng)域，具體則包括測序分析、基因表達(dá)分析、基因調(diào)控及表觀遺

2、傳學(xué)分析、蛋白篩選分析、基因分型及cnv（拷貝數(shù)變異）分析。當(dāng)然最為用戶所知的是30倍磁珠覆蓋產(chǎn)生的業(yè)內(nèi)最高重復(fù)度及準(zhǔn)確率，另外基因分型分析作為一種新興遺傳學(xué)技術(shù)，也正成為illumina的一種核心技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)能夠從核酸水平分析導(dǎo)致個(gè)體疾病的遺傳變異，為多基因復(fù)雜疾病易感性，復(fù)雜疾病的發(fā)生機(jī)制和疾病防治與藥物開發(fā)等領(lǐng)域的研究提供幫助。在illumina領(lǐng)先技術(shù)引導(dǎo)下，以大規(guī)模snp基因分型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)將為未來的個(gè)體化疾病診斷奠定基礎(chǔ)。illumina并購新一代高通量測序技術(shù)公司solexa后，測序成為illumina另一項(xiàng)核心技術(shù)，華大基因（bgi）近日花巨資購買的128

3、臺(tái)最新的測序系統(tǒng)-hiseq 2000系統(tǒng)是illumina公司新發(fā)布的最高通量測序系統(tǒng)。利用兩個(gè)流動(dòng)槽和一種新穎的雙表面成像方法，hiseq 2000能夠在單次運(yùn)行中產(chǎn)生600 gb的數(shù)據(jù)，每天能產(chǎn)生75 gb。該平臺(tái)已經(jīng)將人類基因組的測序費(fèi)用降至1萬美元以下。要知道早在幾年前人類基因組計(jì)劃全球數(shù)個(gè)國家花費(fèi)了數(shù)億美元才完成這項(xiàng)工作。晶能（genergy）生物技術(shù)有限公司是illumina自中國區(qū)總部移到上海后，聯(lián)合各方資源成立的專業(yè)服務(wù)平臺(tái)公司，公司成立以來完成了數(shù)百項(xiàng)服務(wù)項(xiàng)目，在華東地區(qū)競爭激烈的科研外包服務(wù)市場取得不錯(cuò)比例的市場份額，也贏得了客戶的認(rèn)可，公司服務(wù)實(shí)驗(yàn)室裝備華東地區(qū)第一臺(tái)h

4、iseq2000測序儀，已經(jīng)完美運(yùn)作完成數(shù)十項(xiàng)二代深度測序項(xiàng)目。芯片平臺(tái)如iscan平臺(tái)至今已完成3項(xiàng)gwas項(xiàng)目，總計(jì)5000個(gè)樣本；各類基因芯片總計(jì)3500張。sequenom質(zhì)譜檢測系統(tǒng)完成近20萬個(gè)snp位點(diǎn)分型。熒光定量服務(wù)近百項(xiàng)。晶能旨在能為廣大科研開發(fā)工作者提供專業(yè)可靠的分子生物學(xué)科研外包服務(wù)。 snp檢測技術(shù)背景人類基因組計(jì)劃的完成,標(biāo)志著人們進(jìn)入了新的時(shí)代-后基因組學(xué)時(shí)代，人們從基因的序列研究跨越到功能的研究。人類基因組計(jì)劃完成后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)任意兩個(gè)不相關(guān)的人的dna序列有99.9%是一致的，只有0.1%的差異。而這部分0.1%由于包含了遺傳上的差異因素而非常重要。這些差異造

5、成人們罹患疾病的不同風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)藥物的不同反應(yīng)。單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms, snp）成為研究及標(biāo)記人與人之間微小差異的最佳遺傳標(biāo)記。 snp是在基因組中，不同個(gè)體的dna序列上的單個(gè)堿基的差異。如，某些人的染色體上某個(gè)位置的堿基是a，而另一些人的染色體的相同位置上的堿基則是g。除性染色體外，每個(gè)人體內(nèi)的染色體都有兩份。一個(gè)人所擁有的一對(duì)等位位點(diǎn)的類型被稱作基因型（genotype）。檢定一個(gè)人的基因型，被稱作基因分型（genotyping）。人類的基因不到三萬個(gè)，存在超過1千萬個(gè)snp，其中3百萬個(gè)snp決定了人類的異質(zhì)性。snp的篩選及檢測來

6、發(fā)現(xiàn)于疾病相關(guān)的snp位點(diǎn)，是了解引起人類疾病的復(fù)雜原因的最重要途徑之一。同時(shí)這些snp位點(diǎn)也標(biāo)記著不同個(gè)體罹患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以及對(duì)藥物的不同反應(yīng)。snp是繼rflp和str后的第三代分子遺傳標(biāo)記，以其為標(biāo)簽，可尋找和發(fā)現(xiàn)疾病（如腫瘤，高血壓，心臟病，各種精神性疾病等等）相關(guān)的基因。常用的方法是將一定數(shù)量的病人檢體與正常人檢體作相關(guān)基因的snp 分析，觀察特定snp 在兩組人群中出現(xiàn)頻率的差別。隨著基因分型技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多與疾病有關(guān)的基因以及藥物效應(yīng)的個(gè)體差異與基因多型性的關(guān)系被闡明，snp 成為未來醫(yī)學(xué)中個(gè)體化的疾病防治提供基礎(chǔ)，即朝向針對(duì)不同患者的基因型態(tài)施以個(gè)人化醫(yī)療的方向發(fā)展

7、。用于snp分型的技術(shù)有高分辨率熔解（high-resolution melting，簡稱hrm）分析技術(shù) ，基于一代sanger測序技術(shù)的分型方法，基于質(zhì)譜技術(shù)的sequenom massarray 分子量陣列技術(shù)，及基于illumina goldengate專利的定制芯片分型技術(shù)。目前前兩者技術(shù)因?yàn)榉中统杀具^高逐漸為后面三種技術(shù)所取代，而當(dāng)單一樣本需要同時(shí)分型的位點(diǎn)數(shù)超過100個(gè)時(shí)，illumina goldengate技術(shù)的成本是最低的且國際上公認(rèn)度最高。人類全基因組計(jì)劃完成后，全球多個(gè)國家合作（美國，英國，日本，中國等）啟動(dòng)了一項(xiàng)后續(xù)計(jì)劃，人類單體型計(jì)劃(hapmap計(jì)劃)，這個(gè)計(jì)劃的

8、目的就是研究snp位點(diǎn)和疾病的關(guān)系，旨在建立一個(gè)人類健康、疾病以及對(duì)藥物和環(huán)境因子的個(gè)體反應(yīng)差異相關(guān)的基因公用數(shù)據(jù)庫。這一全球性計(jì)劃有70%的數(shù)據(jù)就是在goldengate這個(gè)專利技術(shù)平臺(tái)上產(chǎn)生的，其中中國科學(xué)家承擔(dān)了共10%的工作，這中間95%工作都是在goldengate技術(shù)平臺(tái)上完成的（見nature2005年10月封面文章）。下附幾種snp分型技術(shù)比較表:snp分型技術(shù)比較表技術(shù)名稱原理簡述單次反應(yīng)通量平臺(tái)儀器單樣本單位點(diǎn) 分析成本hrm snp分析技術(shù)通過不同基因型不同pcr反應(yīng)時(shí)候退火溫度不同，從溶解曲線的差異識(shí)別基因型每個(gè)樣本1個(gè)位點(diǎn)一次反應(yīng)熒光定量pcr儀器50萬20-30元一

9、代sanger測序技術(shù)通過對(duì)snp位點(diǎn)前后一段序列測序知道基因型每個(gè)樣本1個(gè)位點(diǎn)一次反應(yīng)測序儀150萬20元sequenom massarraysnp分析技術(shù) 由于snp位點(diǎn)不同堿基的分子量差別，質(zhì)譜方法識(shí)別通過磁場到達(dá)接收裝置時(shí)間不同來識(shí)別基因型每個(gè)樣本最多30個(gè)位點(diǎn)一次反應(yīng)sequenom 質(zhì)譜儀300萬8-10元illumina goldengatesnp分析技術(shù)針對(duì)特定snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)2-3組探針，其中只有一組探針可以完成擴(kuò)增，帶入的堿基因?yàn)槭孪葮?biāo)記的特定波長熒光信號(hào)而被識(shí)別每個(gè)樣本最多1536個(gè)位點(diǎn)一次反應(yīng)illumina微珠芯片工作站150萬5元當(dāng)樣本量及同時(shí)分析樣本數(shù)多時(shí)更低要求同

10、時(shí)分析樣本數(shù)480以上 附1：goldengate的基本原理如下:1 .準(zhǔn)備gdna 250ng2 .將gdna和固相磁性小珠相連3.加入根據(jù)snp位點(diǎn)特殊分析設(shè)計(jì)的探針組opa，如snp是t/c位點(diǎn)，則合成的等位基因特異性探針末端為a/g；通過等位基因特異性延伸和連接酶連接得到一段包含該snp位點(diǎn)的片斷。同時(shí)該片斷帶有一段特殊設(shè)計(jì)的地址序列。4.該片斷進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并在反應(yīng)過程中加入cy3,cy5熒光5.雜交：和芯片進(jìn)行雜交，芯片的微珠上連接有地址序列（address）的互補(bǔ)序列，通過地址序列完成雜交，雜交效率幾乎完全一致。snp位點(diǎn)通過兩種熒光顏色讀取區(qū)分goldengate檢測技術(shù)和v

11、eracode平臺(tái)相結(jié)合，可以靈活地根據(jù)實(shí)驗(yàn)者需要在一個(gè)樣品中檢測48，96，144，192或384個(gè)snp位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的設(shè)計(jì)挑選靈活，完全根據(jù)需要而定。在檢測中，根據(jù)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)組不同的探針，每一組分別代表一個(gè)snp的等位基因goldengate 檢測的特點(diǎn)1.高度靈活：內(nèi)容高度靈活：完全根據(jù)研究需要確定snp位點(diǎn)制成芯片，每個(gè)樣品可同時(shí)進(jìn)行384, 768, 1536 plex snp位點(diǎn)的研究。芯片形式靈活：客戶可根據(jù)樣本量以及snp位點(diǎn)數(shù)量來確定使用何種格式的芯片illumina公司的芯片有三種格式，universal-12，universal-16，universal-32，每張

12、芯片進(jìn)行12，16，32個(gè)樣本的檢測，可針對(duì)384,768,1536個(gè)snp位點(diǎn)進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)。universal-32 beadchip2.實(shí)驗(yàn)成功率高：goldengate 檢測芯片采用了特殊的設(shè)計(jì)，芯片的微珠上僅帶有地址序列而沒有基因組的對(duì)應(yīng)序列，不同snp位點(diǎn)的檢測差異在opa探針組的設(shè)計(jì)上實(shí)現(xiàn)，這一專利的設(shè)計(jì)使芯片雜交在地址序列和其互補(bǔ)序列進(jìn)行間接雜交完成，和基因組序列無關(guān)。所有的地址序列都經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)，具有近似的雜交溫度，退火溫度以及cg含量穩(wěn)定等特點(diǎn)，雜交效率很高。所以，使用微珠芯片進(jìn)行基因分型實(shí)驗(yàn)的成功率也就很高，成功率一般99%。3.實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高：基于微珠芯片以及golden

13、gate 檢測獨(dú)特的設(shè)計(jì)：每個(gè)snp位點(diǎn)有30倍的重復(fù)，雜交在地址序列間發(fā)生等特點(diǎn)，檢測重復(fù)性99.7%。4.密度高,信息量大：面積直徑為15.75mm1.8mm的微珠芯片包含有900,000個(gè)微珠，其密度高達(dá)400萬/cm2是目前密度最高的芯片，是傳統(tǒng)芯片密度的4-400倍，而其研究通量為傳統(tǒng)基因分型手段的8至48倍。5.低樣品量：250ngdna可檢測1536個(gè)snp位點(diǎn)的基因型信息。6.實(shí)驗(yàn)過程全程監(jiān)控內(nèi)參微珠：芯片中設(shè)計(jì)了幾百個(gè)內(nèi)參微珠對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行監(jiān)控，如：樣品污染，延伸特異性等。genomestudio基因分型分析軟件自動(dòng)報(bào)告實(shí)驗(yàn)監(jiān)控結(jié)果。7.完全均一：微珠芯片采用了微珠和光纖的設(shè)

14、計(jì)，芯片點(diǎn)（微珠）大小完全均一：3微米，點(diǎn)和點(diǎn)之間間距完全均一：5.7微米。解決了傳統(tǒng)芯片點(diǎn)大小，定位難以高度均一的瓶頸問題。8.芯片生產(chǎn)100%qc質(zhì)控：微珠芯片生產(chǎn)過程中專利的解碼技術(shù)，質(zhì)控能深入到每張芯片上每個(gè)微珠每個(gè)特性，保證數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。9. 高性價(jià)比：單個(gè)位點(diǎn)的分析成本是其他技術(shù)的1/4甚至1/10.附2：illumina snp分析技術(shù)部分文獻(xiàn)：sigurdsson s, nordmark g, garnier s, grundberg e, kwan t, et al. (2008) a risk haplotype of stat4 for systemic lupu

15、s erythematosus is over-expressed, correlates with anti-dsdna and shows additive effects with two risk alleles of irf5. hum mol genet17:2868-76. karlsson ek, lindblad-toh k (2008) leader of the pack: gene mapping in dogs and other model organisms. nat rev genet9:713-25. moss?yp, laudenslager m, long

16、o l, cole ka, wood a, et al. (2008) identification of alk as a major familial neuroblastoma predisposition gene. nature455:930-5. cooper gm, johnson ja, langaee ty, feng h, stanaway ib, et al. (2008) a genome-wide scan for common genetic variants with a large influence on warfarin maintenance dose.

17、blood112:1022-7. levran o, londono d, ohara k, nielsen da, peles e, et al. (2008) genetic susceptibility to heroin addiction; a candidate-gene association study. genes brain behavepub ahead of print. , sakamoto h, yoshimura k, saeki n, katai h, et al. (2008) genetic variation in psca is associated w

18、ith susceptibility to diffuse-type gastric cancer. nat genet40:730-40. chambers jc, elliott p, zabaneh d, zhang w, li y, et al. (2008) common genetic variation near mc4r is associated with waist circumference and insulin resistance. nat genet40:716-8. loos rj, lindgren cm, li s, wheeler e, zhao jh,

19、et al. (2008) common variants near mc4r are associated with fat mass, weight and risk of obesity. nat genet40:768-75. plenge rm, seielstad m, padyukov l, lee at, remmers ef, et al. (2007) traf1-c5 as a risk locus for rheumatoid arthritis-a genomewide study. n engl j med357:1199-209. thorleifsson g,

20、magnusson kp, sulem p, walters gb, gudbjartsson df, et al. (2007) common sequence variants in the loxl1 gene confer susceptibility to exfoliation glaucoma. science317:1397-400. fellay j, shianna kv, ge d, colombo s, ledergerber b, et al. (2007) a whole-genome association study of major determinants

21、for host control of hiv-1. science317:944-7. stefansson h, rye db, hicks a, petursson h, ingason a, et al. (2007) a genetic risk factor for periodic limb movements in sleep. n engl j med357:639-47. hakonarson h, grant sf, bradfield jp, marchand l, kim ce, et al. (2007) a genome-wide association stud

22、y identifies kiaa0350 as a type 1 diabetes gene. nature448:591-4. moffatt mf, kabesch m, liang l, dixon al, strachan d, et al. (2007) genetic variants regulating ormdl3 expression contribute to the risk of childhood asthma. nature448:470-3. gudbjartsson df, arnar do, helgadottir a, gretarsdottir s, holm h, et al. (2007) variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. nature448:353-7. van es ma, van vught pw, blauw hm, franke l, saris cg, e