幾種無機離子對黃孢原毛平革菌的酶活性影響分析

1、幾種無機離子對黃孢原毛平革菌的酶活性影響分析陳英 基金項目：蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院2012年度科研創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（ITM）作者簡介：陳英（1979-），女，江蘇南通人，碩士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究。E-mail：。，楊偉球，邱學(xué)林，林惠菲（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生態(tài)環(huán)境系，江蘇 蘇州，）摘 要：以黃孢原毛平革菌為代表的白腐真菌，其分泌的木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）等酶系能降解木質(zhì)素以及前體類似物。本研究對幾種無機金屬離子、無機陰離子對黃孢原毛平革菌所產(chǎn)酶系中的木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶活性影響進行了比對分析。結(jié)

2、果表明，F(xiàn)e3+對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）都有很強的抑制作用，F(xiàn)e2+、Ca2+對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）表現(xiàn)出不同的促進作用，Br-比Cl-的激活作用稍弱。關(guān)鍵詞：黃孢原毛平革菌；木質(zhì)素過氧化物酶；錳過氧化物酶；酶活The Impact of Inorganic Ions on Enzymatic Activity of Phanerochaete chrysosporiumChen Ying，Yang Wei-qiu，Qiu Xue-lin，Lin Hui-fei（Suzhou Polytechnic Institute of Agric

3、ulture, Suzhou Jiangsu ）Abstract：As the representative of White-rot Fungus, Phanerochaete chrysosporium can secrete Lignin peroxides and Manganese peroxides and so on, which can depredate Lignin and Precursor analogs. Through using Inorganic ions and Organic molecules as Activator，Enzyme activity in

4、 different conditions was researched. The results show that Fe3+ on LiP and MnP had strong inhibitory effect, but Fe2+ and Ca2+ on those showed different promoting effect, And Br- than Cl- activation in vitro mp, EDTA is lifting of heavy metal ions on enzyme inhibition.Keyword：Phanerochaete chrysosp

5、orium，Lignin Peroxides，Manganese peroxides，Enzymatic activity木質(zhì)素廣泛存在于植物細胞中，是自然界中含量最多的有機可再生資源。在植物體內(nèi)，木質(zhì)素通過化學(xué)鍵和半纖維素連接，然后包裹在纖維素外，形成木質(zhì)纖維素。木質(zhì)素由于具有各種生物學(xué)穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型而不易被微生物降解。要解決如何高效利用木質(zhì)纖維素這一問題，關(guān)鍵在于如何降解包裹在纖維素晶體外面的木質(zhì)素以及半纖維素，從而增加纖維素表面積，使纖維素易于降解和利用1。隨著人類可利用資源的越來越緊缺,木質(zhì)素的微生物降解成了當今研究的熱點。白腐真菌作為已知的唯一可獨立降解木質(zhì)素的微生物，其能分泌木質(zhì)素

6、過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）等酶降系統(tǒng)2。在黃孢原毛平革菌的整個生長階段，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的合成量要比錳過氧化物酶（MnP）大得多，它在木質(zhì)素降解中起主要作用。同時，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）是降解木質(zhì)素的模型物，因此木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）在木質(zhì)素降解中起主導(dǎo)作用3。而錳過氧化物酶（MnP）是幾乎所有的木生白腐菌和各種土壤中的枯葉分解真菌所產(chǎn)生的，是最為普遍的木質(zhì)素修飾過氧化物酶4。本文對幾種無機金屬離子、無機陰離子對黃孢原毛平革菌所產(chǎn)酶系中的木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶活性影響進行研究，以期通過比對分析，來為這兩

7、種酶的大規(guī)模應(yīng)用提供一定的參考數(shù)據(jù)。1 材料與試驗方法1.1試驗材料1.1.1菌種 選用白腐真菌中的黃孢原毛平革菌為研究對象。1.1.2培養(yǎng)基 （1）固體PDA培養(yǎng)基土豆浸出液200g，葡萄糖20g，瓊脂20g。（2）液體培養(yǎng)基葡萄糖（碳源）10g/L、酒石酸銨（氮源）1.2mmol/L、醋酸-醋酸鈉緩沖液0.2mol/L、KH2PO42.0g/L、CaCl2 0.130g/L、MgSO47H2O 1.5g/L、吐溫-80 0.5g/L、VA 0.4mmol/L以及微量元素混合液10mL。（3）微量元素混合液MnSO4 2.9mmol/L、CaCl2 1.0mmol/L、NaCl 0.15mm

8、ol/L、NaBr 0.15mmol/L、ZnCl2 0.345mmol/L、FeSO4 0.358mmol/L、CuSO4 0.4mmol/L、CoCl2 6H20 0.458mmol/L、KAl（SO4）212H2O 0.022mmol/L、HBO3 0.16mmol/L、NaMoO42H2O 0.042mmol/L。1.1.3主要儀器設(shè)備 752型紫外-可見分光光度計，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器，SHZ型水浴恒溫振蕩器。1.2試驗方法1.2.1粗酶液的制備將黃孢原毛平革菌接種在固體PDA培養(yǎng)基上，置于30恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌種長滿整個平板后

9、取8mm菌塞，250mL搖裝入液體培養(yǎng)基100mL，接入菌塞2個。30、120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。選取黃孢原毛平革菌第8d的培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min、15min離心后取上清液作為粗酶液。1.2.2酶活測定木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）：50mmol/L的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH值約2.5）、去離子水、2mmol/L的蔾蘆醇、4mmol/L H2O2以及一定量的粗酶液，用紫外-可見分光光度計檢測310nm處在2.5min內(nèi)吸光值變化；定義氧化1mol/min蔾蘆醇成蔾蘆醛所需的酶量為1個酶活力單位。錳過氧化物酶（MnP）：50mmol/L的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH值約5）、1.6mmo

10、l/L H2O2、6mmol/L MnSO4以及一定量的粗酶液，用紫外-可見分光光度計檢測310nm處在4min內(nèi)吸光值變化；定義氧化1mol/min Mn2+為Mn3+所需的酶量為1個酶活力單位。木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的性質(zhì)測定方面，分別選擇Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ag+等金屬離子，以及陰離子NO3-、Cl-、Br-作為效應(yīng)物，在酶活力測試體系中，加入不同濃度的效應(yīng)物，測定酶的相對活力。2 結(jié)果與分析2.1不同金屬離子對酶活性的影響向反應(yīng)體系中加入濃度為50mmol/L金屬離子溶液，使反應(yīng)體系最終金屬離子濃度為5m

11、mol/L，預(yù)熱至37，加入1.6mmol/L的H2O2溶液0.1mL啟動反應(yīng)，測定反應(yīng)最初3分鐘內(nèi)=240nm處吸光度變化。其余相同溫度、pH條件下測定酶活5。結(jié)果如圖1、2所示。酶活力Enzyme activity（%）020406080100120140160180481216202428濃度Concentration（mmol/L)123456789圖1 不同金屬離子濃度與LiP酶活力關(guān)系圖（注：1Na+，2K+，3Mg2+，4Zn2+，5Fe2+，6Fe3+，7Ca2+,8Cu2+，9Ag+）由圖1可知，隨著Ca2+濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力增加，這說明Ca2+對

12、木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定促進作用。而隨著Na+濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力減小，這說明Na+對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。而隨著K+和Mg2+濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力變化不明顯。Zn2+只有在濃度達到24mmol/L才表現(xiàn)出明顯的促進作用，隨之到達28mmol/L,又迅速降到原來水平。而隨著Fe2+濃度從4mmol/L增加到24mmol/L，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力由慢而快地增大，超過12mmol/L，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力又由快到慢地降到原來水平。這說明Fe2+濃度為12mmol/L時，酶活力最高

13、。Fe3+則是隨著濃度的增加，到28mmol/L時，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力降到近乎喪失了酶活力，這說明Fe3+對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。在48mmol/L時，隨著Cu2+濃度的增加，酶活也增加；當Cu2+濃度為8mmol/L時，酶活最高；8mmol/L之后，酶活隨著Cu2+濃度的增加而降低。而Ag+濃度幾乎不影響木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活性。圖2 不同金屬離子濃度與MnP酶活力關(guān)系圖 （注：1Na+，2K+，3Mg2+，4Zn2+，5Fe2+，6Fe3+，7Ca2+,8Cu2+，9Ag+）由圖2可知，在同樣條件下，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也隨金屬

14、離子濃度改變而異。隨著Ca2+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力逐漸增加，這說明Ca2+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活也有一定促進作用。而隨著Na+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力減小，這說明Na+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活也有一定抑制作用。而隨著K+和Mg2+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也變化不明顯。Zn2+只有在濃度達到24mmol/L才表現(xiàn)出明顯的促進作用，隨之到達28mmol/L,又迅速降到原來水平。這點與對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的作用類似。但是，較對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活影響有所不同的是，F(xiàn)e2+始終對錳過氧化物酶的酶活起促進作用，而

15、且錳過氧化物酶（MnP）的酶活力與濃度成正比。Fe3+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活也有一定抑制作用，而且錳過氧化物酶（MnP）的酶活力與Fe3+濃度成反比。在48mmol/L時，隨著Cu2+濃度的增加，酶活也增加，當Cu2+濃度為8mmol/L時，酶活最高；8mmol/L之后，酶活隨著Cu2+濃度的增加而降低，這與對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活影響比較分析，其結(jié)果近乎類似。而Ag+濃度也幾乎不影響錳過氧化物酶（MnP）的酶活力。2.2陰離子對酶活性的影響向反應(yīng)體系中加入濃度為50mmol/L陰離子表面活性劑，使反應(yīng)體系最終陰離子濃度為5mmol/L，預(yù)熱至37，加入1.6mmol/L的H

16、2O2溶液0.1mL啟動反應(yīng)，測定反應(yīng)最初3分鐘內(nèi)=240nm處吸光度變化。其余相同溫度、pH條件下測定酶活6。結(jié)果如圖3所示。圖3 不同陰離子濃度與LiP酶活力關(guān)系圖（注：1Cl-，2Br-，3NO3-）由圖3可知，陰離子表面活性劑對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力有明顯的影響。在1530mmol/L時，隨著Br-和Cl-濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力升高，這說明Br-和Cl-對木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定促進作用。在30105mmol/L時，隨著Br-和Cl-濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力降低，酶活力與濃度關(guān)系成反比，這說明Br-和Cl-對木質(zhì)素

17、過氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。結(jié)果表明，當30mmol/L時，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力達到最大。但是，對其作用方向是激活或是抑制尚無一個統(tǒng)一的結(jié)果，只是Br-比Cl-的激活作用稍弱。而隨著NO3-濃度的增加，木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）的酶活力變化不明顯。3結(jié) 論（1）經(jīng)過木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶學(xué)性質(zhì)對比分析，表明Fe3+對木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶（MnP）都有很強的抑制作用，F(xiàn)e2+、Ca2+則對木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶（MnP）表現(xiàn)出不同的促進作用。此外，Na+對木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)表現(xiàn)出一定的抑制作用，對錳過氧化物酶（MnP）作用卻不明顯，Cu2+對錳過氧化物酶（MnP）有很強的促進作用但對木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)作用不明顯。（2）在陰離子影響酶活性方面，Br-比Cl-的激活作用稍弱。這與具體的反應(yīng)機理有關(guān)，缺乏對照的實驗將很難給出客觀的數(shù)據(jù)分析。參考文獻：1 周群英，王士芬.環(huán)境工程微生物學(xué)M. 北京：高等教育出版社，2010.2 董旭杰，曹福祥，陳靜，呂聰.3種白腐菌木質(zhì)素降解酶的比較J，中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報.2007,27（3）：131-135.3 王敏.白腐菌降解木質(zhì)素研究進展J，衡