衛(wèi)生部《手足口病預(yù)防控制指南2009版》

1、手足口病預(yù)防控制指南（2009版）手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國(guó)法定報(bào)告管理的丙類傳染病。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡。手足口病常出現(xiàn)暴發(fā)或流行，為指導(dǎo)各地做好手足口病的預(yù)防控制工作，制定本指南。一、目的（一）指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展疫情報(bào)告與監(jiān)測(cè)。（二）指導(dǎo)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展流行病學(xué)調(diào)查、病原學(xué)監(jiān)測(cè)。（三）指導(dǎo)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展重

2、點(diǎn)場(chǎng)所及公眾預(yù)防控制工作。二、疾病概述（一）病原學(xué)。引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B組（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）；?？刹《荆‥chovirus, ECHO）等。其中以EV71及CVA16型較為常見。腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和5%來蘇不能將其滅活，對(duì)乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對(duì)紫外線和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛

3、、碘酒以及5630分鐘可以滅活病毒。病毒在4可存活1年，-20可長(zhǎng)期保存，在外環(huán)境中可長(zhǎng)期存活。（二）流行病學(xué)。1傳染源。人是人腸道病毒的唯一宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源，隱性感染者難以鑒別和發(fā)現(xiàn)。發(fā)病前數(shù)天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內(nèi)傳染性最強(qiáng)。2傳播途徑。腸道病毒可經(jīng)胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。尚不能明確是否可經(jīng)水或食物傳播。3易感性。人對(duì)人腸道病毒普遍易感。不同年齡組均可感染發(fā)病，以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。顯性感染和隱性

4、感染后均可獲得特異性免疫力，產(chǎn)生的中和抗體可在體內(nèi)存留較長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)同血清型病毒產(chǎn)生比較牢固的免疫力，但不同血清型間鮮有交叉免疫。4流行特征。該病流行無明顯的地區(qū)性，全年均可發(fā)生，一般5-7月為發(fā)病高峰。托幼機(jī)構(gòu)等易感人群集中單位可發(fā)生暴發(fā)。腸道病毒傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，控制難度大，容易出現(xiàn)暴發(fā)和短時(shí)間內(nèi)較大范圍流行。（三）臨床表現(xiàn)。手足口病潛伏期為2-10天，平均3-5天，病程一般為7-10天。急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，皰疹周圍可有炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少?？砂橛锌人?、流涕、食欲不振等癥狀。部分患者無發(fā)熱，僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹

5、。一般預(yù)后良好；少數(shù)病例，特別是EV71感染患兒，可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫、循環(huán)障礙等，病情兇險(xiǎn)，可致死亡或留有后遺癥。（四）治療原則。 目前無特異性治療方法，以支持療法為主，絕大多數(shù)患者可自愈。目前尚無特異性的疫苗。病例的治療方法參考衛(wèi)生部手足口病診療指南（2008年版）。三、病例定義（一）臨床診斷病例。在流行季節(jié)發(fā)病，常見于學(xué)齡前兒童，嬰幼兒多見。1普通病例：發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發(fā)熱。2重癥病例：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查可有外周血白細(xì)胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動(dòng)圖檢查可有異常。極

6、少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)做出診斷。若無皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。（二）實(shí)驗(yàn)室確診病例。臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實(shí)驗(yàn)室確診病例：1自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）。2自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標(biāo)本中檢測(cè)到CVA16 或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本等標(biāo)本中檢測(cè)到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）的特

7、異性核酸。3血清標(biāo)本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度1256，或急性期與恢復(fù)期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。（三）聚集性病例。1周內(nèi)，同一托幼機(jī)構(gòu)或?qū)W校等集體單位發(fā)生5例及以上手足口病病例；或同一班級(jí)（或宿舍）發(fā)生2例及以上手足口病病例；或同一自然村發(fā)生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發(fā)生2例及以上手足口病病例。四、疾病監(jiān)測(cè)（一）疫情報(bào)告。1個(gè)案報(bào)告。各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)按照中華人民共和國(guó)傳染病防治法和傳染病信息報(bào)告管理規(guī)范的有關(guān)規(guī)定，對(duì)符合病例定義的手足口病病例進(jìn)行報(bào)告。如為重癥病例，請(qǐng)?jiān)凇爸匕Y患者”處選擇“是”；如為實(shí)驗(yàn)室診斷病例，請(qǐng)?jiān)凇皩?shí)驗(yàn)室結(jié)果”處選擇相應(yīng)的腸道病毒病

8、原學(xué)分型信息。實(shí)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)，未實(shí)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)于24小時(shí)之內(nèi)寄送出傳染病報(bào)告卡。2聚集性病例報(bào)告。托幼機(jī)構(gòu)和學(xué)校、醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例時(shí)，應(yīng)以最快的方式向縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告。3. 突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告。局部地區(qū)或集體單位發(fā)生流行或暴發(fā)時(shí)，按照突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例、全國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急預(yù)案、突發(fā)公共衛(wèi)生事件與傳染病疫情監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理辦法及有關(guān)規(guī)定，及時(shí)進(jìn)行突發(fā)公共衛(wèi)生事件信息報(bào)告。（二）病原學(xué)監(jiān)測(cè)。各省區(qū)市衛(wèi)生行政部門要組織醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開展病原學(xué)監(jiān)測(cè)，了解病原動(dòng)態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區(qū)）為單

9、位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本；當(dāng)月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時(shí)，全部采樣。以?。▍^(qū)、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對(duì)EV71 和10對(duì)CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。以省（區(qū)、市）為單位，每月至少?gòu)氖肿憧诓〔±蟹蛛x10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。具備測(cè)序條件的省份，可開展VP1基因序列測(cè)定和分析，進(jìn)行基因定型，序列測(cè)定完成后將序列結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心；不具備測(cè)

10、序條件者，將毒株送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行序列測(cè)定，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心要于28個(gè)工作日內(nèi)反饋基因定型結(jié)果。所有病例的采樣均由醫(yī)療機(jī)構(gòu)完成，及時(shí)送至縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)或指定的檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果于24小時(shí)內(nèi)反饋給縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)；縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)接到結(jié)果后，于24小時(shí)內(nèi)對(duì)檢測(cè)病例的傳染病報(bào)告卡信息進(jìn)行訂正，將其病例類型訂正為“實(shí)驗(yàn)室診斷”，并在“實(shí)驗(yàn)室結(jié)果”處補(bǔ)填腸道病毒病原學(xué)分型信息。各種標(biāo)本采集和檢測(cè)方法詳見手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案（附件1）。（三）監(jiān)測(cè)信息分析與反饋。各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要每日對(duì)網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)進(jìn)行瀏覽，及時(shí)對(duì)報(bào)告的病例進(jìn)

11、行審核、查重、訂正等工作，定期對(duì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷發(fā)病趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)異常升高或病例呈聚集性分布或出現(xiàn)重癥及死亡病例時(shí)，要及時(shí)核實(shí)并向同級(jí)衛(wèi)生行政部門及上級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告，并定期向下級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)反饋疫情分析信息。五、預(yù)防控制（一）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查處置。發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例、重癥或死亡時(shí)，縣（區(qū)）級(jí)及以上疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要立即組織開展現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查處置。1流行病學(xué)調(diào)查。（1）聚集性病例調(diào)查：了解聚集性病例的臨床表現(xiàn)、流行特征，以分析流行因素，為采取防控措施提供依據(jù)。要對(duì)首發(fā)或指示病例開展流行病學(xué)調(diào)查，填寫手足口病個(gè)案調(diào)查表（附件2）。（2）重癥或死亡病例調(diào)查：詳細(xì)了解病例的基本信息、臨床

12、癥狀、發(fā)病就診治療過程、感染傳播情況、病原檢測(cè)結(jié)果，以分析重癥及死亡病例的主要危險(xiǎn)因素，填寫手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調(diào)查表（附件3）。調(diào)查結(jié)束后，各省級(jí)疾病預(yù)防控制中心應(yīng)將結(jié)果錄入統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)，報(bào)送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。（3）專題調(diào)查：根據(jù)當(dāng)?shù)厥肿憧诓∫咔樘攸c(diǎn)及流行特征，可開展專題調(diào)查，以了解當(dāng)?shù)氐闹饕獋鞑シ绞揭约案腥疚ｋU(xiǎn)因素等，為制定干預(yù)措施提供依據(jù)。專題調(diào)查的方案及其內(nèi)容，應(yīng)根據(jù)調(diào)查目的專門設(shè)計(jì)。（4）醫(yī)療機(jī)構(gòu)要協(xié)助疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對(duì)病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。2傳染源的管理?；純簯?yīng)及時(shí)就醫(yī)，并遵醫(yī)囑采取居家或住院方式進(jìn)行治療。居家患兒，家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人應(yīng)在社區(qū)（村）醫(yī)生的指導(dǎo)下，密切關(guān)注患兒的病情

13、變化，如發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等相關(guān)癥狀時(shí)，應(yīng)立即送醫(yī)院就診，同時(shí)，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應(yīng)在指定區(qū)域內(nèi)接受治療，防止與其他患兒發(fā)生交叉感染。管理時(shí)限為自患兒被發(fā)現(xiàn)起至癥狀消失后1周。鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院/社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、村衛(wèi)生室/社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站等負(fù)責(zé)本轄區(qū)居家治療的手足口病患兒的隨訪工作，掌握居家治療患兒的病情進(jìn)展情況。3標(biāo)本采集和檢測(cè)。（1）所有重癥和死亡病例均要采集標(biāo)本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。聚集性病例至少要采集2例病例標(biāo)本開展病原學(xué)檢測(cè)。（2）醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)樣本采集，疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)

14、行相關(guān)生物學(xué)標(biāo)本的采集。（3）疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)根據(jù)本地的技術(shù)能力，對(duì)采集的標(biāo)本開展核酸檢測(cè)、病毒分離；不具備技術(shù)條件時(shí)，及時(shí)送上級(jí)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)（附件1）。4消毒措施。病家、托幼機(jī)構(gòu)和小學(xué)的消毒應(yīng)在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)下，由單位及時(shí)進(jìn)行消毒，或由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)對(duì)其進(jìn)行消毒處理。醫(yī)療機(jī)構(gòu)的消毒由醫(yī)療機(jī)構(gòu)安排專人進(jìn)行。消毒方法參見消毒技術(shù)規(guī)范（2002版）和手足口病疫源地消毒指南（附件4）。5健康教育。各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)應(yīng)在政府領(lǐng)導(dǎo)下，與當(dāng)?shù)亟逃?、宣傳、廣電等部門密切合作，充分利用12320公共衛(wèi)生公益熱線、廣播、電視、報(bào)紙、網(wǎng)絡(luò)、手機(jī)短信、宣傳單/宣傳畫等多種方式，開展手足口病防治知

15、識(shí)的宣傳工作，使5歲以下兒童家長(zhǎng)及托幼機(jī)構(gòu)工作人員等了解手足口病的臨床癥狀，掌握最基本的預(yù)防措施，強(qiáng)調(diào)保持良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣及環(huán)境衛(wèi)生措施對(duì)于有效預(yù)防手足口病的重要性，動(dòng)員托幼機(jī)構(gòu)老師和管理人員、兒童家長(zhǎng)成為手足口病防控工作的主動(dòng)參與者，形成群防群控。與重癥或死亡病例發(fā)病前1周或發(fā)病后有共同生活、居住史的5歲以下兒童，要對(duì)其家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人進(jìn)行健康教育，做好兒童的密切觀察，出現(xiàn)癥狀要及時(shí)就診和治療。（二）重點(diǎn)人群及重點(diǎn)機(jī)構(gòu)的預(yù)防控制措施。為降低人群手足口病的發(fā)病率，減少聚集性病例，避免醫(yī)院感染，各地要做好以散居兒童為主的重點(diǎn)人群和以托幼機(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)為主的重點(diǎn)場(chǎng)所的預(yù)防控制工作。1散居兒童的預(yù)防控

16、制措施。（1）飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看護(hù)人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；（2）嬰幼兒的尿布要及時(shí)清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環(huán)境衛(wèi)生，居室要經(jīng)常通風(fēng)，勤曬衣被；（3）嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應(yīng)充分清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；（4）本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場(chǎng)所；避免接觸患病兒童；（5）兒童出現(xiàn)發(fā)熱、出疹等相關(guān)癥狀要及時(shí)到醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診；（6）居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父母要及時(shí)對(duì)患兒的衣物進(jìn)行晾曬或消毒，對(duì)患兒糞便及時(shí)進(jìn)行消毒處理。2托幼機(jī)構(gòu)預(yù)防控制措施。（1）每日

17、進(jìn)行晨檢，發(fā)現(xiàn)可疑患兒時(shí)，要采取立即送診、居家觀察等措施；對(duì)患兒所用的物品要立即進(jìn)行消毒處理；（2）出現(xiàn)重癥或死亡病例，或1周內(nèi)同一班級(jí)出現(xiàn)2例及以上病例，建議病例所在班級(jí)停課10天；1周內(nèi)累計(jì)出現(xiàn)10例及以上或3個(gè)班級(jí)分別出現(xiàn)2例及以上病例時(shí)，經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后，可建議托幼機(jī)構(gòu)停課10天；（3）教育、指導(dǎo)兒童養(yǎng)成正確洗手等良好的衛(wèi)生習(xí)慣；老師要保持良好的個(gè)人衛(wèi)生狀況；（4）教室和宿舍等場(chǎng)所要保持良好通風(fēng)；定期對(duì)玩具、兒童個(gè)人衛(wèi)生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品進(jìn)行清洗消毒；（5）定期對(duì)活動(dòng)室、寢室、教室、門把手、樓梯扶手、桌面等物體表面進(jìn)行擦拭消毒；（6）托幼機(jī)構(gòu)應(yīng)每日對(duì)廁所進(jìn)行清掃、消毒，工作人

18、員應(yīng)戴手套，工作結(jié)束后應(yīng)立即洗手；（7）托幼機(jī)構(gòu)應(yīng)配合衛(wèi)生部門采取手足口病防控措施。3醫(yī)療機(jī)構(gòu)的預(yù)防控制措施。（1）各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)預(yù)檢分診，專辟診室（臺(tái)）接診發(fā)熱、出疹的病例。增加候診及就診等區(qū)域的清潔消毒頻次，室內(nèi)清掃時(shí)應(yīng)采用濕式清潔方式；（2）醫(yī)務(wù)人員在診療、護(hù)理每一位病例后，均應(yīng)認(rèn)真洗手或?qū)﹄p手消毒，或更換使用一次性手套；（3）診療、護(hù)理手足口病病例過程中所使用的非一次性儀器、體溫計(jì)及其他物品等要及時(shí)消毒；（4）對(duì)住院患兒使用過的病床及桌椅等設(shè)施和物品必須消毒后才能繼續(xù)使用；（5）患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進(jìn)行消毒處理。附件：1手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案2手足口病個(gè)

19、案調(diào)查表3手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調(diào)查表4手足口病疫源地消毒指南附件1 手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸（一）糞便標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽，4暫存12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（二）咽拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采

20、樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。4暫存并在12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70冰箱。（三）血清標(biāo)本。各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對(duì)血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。將血

21、清置于-20以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液。在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。（五）肛拭子標(biāo)本。采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適

22、度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（含5%牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。（六）尸檢標(biāo)本。采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨(dú)的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個(gè)，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。（七）腦脊液標(biāo)本。出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.

23、0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，20以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于70冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，很難在腦脊液中檢測(cè)到EV71病原。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運(yùn)輸，12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。依照人間傳染的病原微生物名錄，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運(yùn)輸，盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運(yùn)輸方式，但在運(yùn)輸過程中應(yīng)采取保護(hù)措施，避免強(qiáng)烈震動(dòng)、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級(jí)CDC實(shí)驗(yàn)室時(shí)，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標(biāo)本的同時(shí)，需附帶相關(guān)的手足口病病例

24、臨床標(biāo)本采樣登記表。二、標(biāo)本采集注意事項(xiàng)在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標(biāo)本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集與病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。標(biāo)本保存液的配置見下表：保存液Eagles液(MEM)80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、鏈霉素（各10000U/

25、ml）10ml三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程（一）病毒分離。1.試劑配置（1）細(xì)胞的生長(zhǎng)液、維持液的配制見下表：生長(zhǎng)液（GM）維持液（MM）Eagles液(MEM)86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理液完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100g/ ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。A液：試劑品名加入量NACL8.00gKCL0.2

26、0gNa2HPO4(無水)0.91gKH2PO40.12g用600800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補(bǔ)至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。B液：試劑品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。C液： 試劑品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。2病毒分離細(xì)胞系許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長(zhǎng)。對(duì)于檢測(cè)手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標(biāo)本均需接種到

27、以下兩種細(xì)胞系： RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。 HEp-2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)胞。3標(biāo)本的處理（1）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理操作步驟：1）在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào)；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號(hào)與原始標(biāo)本的標(biāo)號(hào)一致）；肛拭子為2ml；4）剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于20；5）確保擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20min；6）在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)在1500g條件下離心20min；7）在生物安全柜中將每1份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋

28、蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理1次）；8） 1管糞便懸液凍存于20作為備份，另1管存于4-8以備接種。（2）皰疹液標(biāo)本的處理皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標(biāo)本的處理腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標(biāo)本的處理咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。4接種和觀察（病毒分離）（1）通常使用ml的斜面

29、試管培養(yǎng)細(xì)胞，傳細(xì)胞時(shí)，每管加細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康、無污染的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后48小時(shí)左右形成；（2）倒掉生長(zhǎng)液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；（5）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36。（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標(biāo)本前，倒掉生長(zhǎng)液（GM），每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36；吸附1小時(shí)后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標(biāo)本需

30、同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+， Ct值35.0的樣本為臨界值。Ct值38.0的樣本或無數(shù)值的標(biāo)本為陰性。（2） One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸（雙通道檢測(cè)）雙通道可以同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時(shí)間(2.5小時(shí))內(nèi)檢測(cè)到標(biāo)本中是否含EV71或CVA16核酸。反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系共25l，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5l模板量），不夠部