原核表達(dá)載體

1、原核表達(dá)體系的構(gòu)建劉華彬，董浚鍵、實驗材料1）植物材料：擬南芥2）載體及菌株：克隆及測序用載體為 pMD18-T ，購自 Takara 公司。宿主菌 DH5。原核表達(dá)載體 （pET30c ？）。3）PCR 引物：登陸 GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列為模板設(shè) 計引物。4）藥品試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ TaKaRa），質(zhì)粒小提試劑盒（ TIANGEN ），膠 回收試劑盒， Taq DNA 聚合酶（ TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性內(nèi)切 酶（ TaKaRa），T4 連接酶（ TaKaRa），各種 DNA 和蛋白 marker，各種抗 生素類，、方法1）目的基因的獲得（

2、 RT-PCR）：擬南芥葉片 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA PCR 基因（詳見王希朝那份） ；PCR 產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠分離。先設(shè)計好 PCR 的引物和 PCR的反應(yīng)程序。2）克隆載體的構(gòu)建：. 目的基因的切膠回收： 在紫外燈下迅速用干凈的手術(shù)刀切下含目的基因的瓊脂糖凝膠塊，放 入已稱重的離心管中，在保證目的基因全部回收的同時，應(yīng)盡量減少膠 的體積。 計算凝膠重量（ 100 mg相當(dāng)于 100 l），加入 3倍體積 solution DE-A， 75水浴 6-8 分鐘，其間輕柔地顛倒離心管至膠完全融化。 加入 2倍體積 solution DE-B ，顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室 溫

3、放置 1 min，12000 rpm離心 1 min。 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入 600 l Wash solution，室溫 12000 rpm離心 30 s。 重復(fù)步驟一次。 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫 12000 rpm離心 1 min。 將吸附柱放入新的 1.5 mL 滅菌離心管中，在柱膜中央加入 30 l 75 預(yù)熱的 ddH2O，室溫放置 2 min，12000 rpm離心 1 min 。離心管中的液 體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于 -20備用。. 目的片斷與克隆載體 pMD18-T 連接：pMD 19-T Simple Vector （ T 載

4、體，小紙盒子中）Insert DNAdH2OSolution I （冰中融化，小紙盒子中，跟 T 載體一起）1ul2ul2ul5ul5ul（等量）16 反應(yīng) 30min. E. coli DH5 感受態(tài)細(xì)胞的制備： 將 E. coli DH5在 LB 平板上劃線培養(yǎng)過夜。次日，挑取單克隆，接 種到 5 mL LB 培養(yǎng)基中， 37，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。 將過夜培養(yǎng)的菌液 1 mL 加入到 100 mL LB 培養(yǎng)基中 （1: 100），培養(yǎng)2-3 h至 OD600=0.5，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的無菌離心管中，冰上放置 10 min，然 后于 4下 3000 rpm 離心 10 min。 棄去

5、上清，用預(yù)冷的 0.05 mol/L 的無菌 CaCl2 溶液 10 mL 輕輕懸浮 細(xì)胞，冰上放置 20 min，4下 3000 rpm離心 10 min。 棄去上清，加入 4 mL 預(yù)冷的含 15%甘油的 0.05 mol/L 的 CaCl2 溶液， 輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 感受態(tài)細(xì)胞分裝成 100 l 的小份，于冰上備用，或液氮速凍貯存于 -80。. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli DH5（熱擊法）連接產(chǎn)物加至感受態(tài) E.coli DH52（200ul）或（ 100ul） 【非連接載體 加 2ul 】 【加入后離火遠(yuǎn)點輕輕用手撥】冰上放置 20min42水浴熱擊

6、 90s立即放置冰上 2min（勿震蕩）于超凈工作臺加 800ul LB 培養(yǎng)液37， 150rpm 預(yù)培養(yǎng) 50min6000rpm離心 1min，吸除 800ul 上清；剩余液體用來懸浮沉淀涂布 LB+Amp 平板上， 37倒置培養(yǎng) 12h（于超凈工作臺吹干液體） 。 . 挑取白色單克隆菌落，重懸于 5 l ddH2O 中，取其中 1 l 用于 PCR鑒 定。 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上面獲取目的基因的 PCR 一樣。 . 重組質(zhì)粒的提?。?TIANGEN 質(zhì)粒小提試劑盒，方法可以看試劑盒說明 書） 將以上剩余的 4 l 菌液接種到 5 mL 含 Amp 抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基 中，

7、 37振蕩培養(yǎng)過夜。 取 3 mL 菌液，室溫 12000 rpm離心 1 min。 棄上清，加入 250 l Solution I ，重懸菌體細(xì)胞。 加入 250 l Solution，輕柔顛倒離心管 4-6 次。 加入 350 l Solution，輕柔顛倒離心管 6-8次，此時應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫 12000 rpm離心 10 min。 取上清（注意不要吸到蛋白） ，轉(zhuǎn)入吸附柱，室溫放置 1 min，12000 rpm 離心 1 min。 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入 500 l Wash Solution ，室溫 12000 rpm離心 1 min。 重復(fù)步驟一次。 取下吸

8、附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫 12000 rpm離心 1 min。 將吸附柱放入新的 1.5 mL 滅菌離心管中，在柱膜中央加入 60 l 75 預(yù)熱的 ddH2O，室溫放置 2 min ，12000 rpm離心 1 min。離心管中的 液體即為質(zhì)粒。可立即使用或保存于 -20備用。. 重組質(zhì)粒的酶切鑒定酶切反應(yīng)體系、 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù)內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。 酶切 產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠分離。. 重組質(zhì)粒的目的基因的序列測定重組質(zhì)粒由測序公司測序。 . 菌種保存取 500l 重組菌液加入等體積 50%的無菌甘油 （ 終濃度達(dá)到 25%），液氮 速凍， -80保存。3）目的基因的原核

9、表達(dá). 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 克隆載體的構(gòu)建： 必須考慮使用的克隆載體有無多克隆位點， 沒有就要 特別設(shè)計一對上下游引物， 分別帶上酶切位點， 以便插入原核表達(dá)載體 上相應(yīng)的多克隆位點。構(gòu)建克隆載體的方法參見上面步驟。 重組質(zhì)粒和表達(dá)載體的酶切： 酶切反應(yīng)體系、 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù) 內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。酶切產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠分離。 回收表達(dá)載體酶切片斷和目的基因酶切片斷：i. 在紫外燈下迅速用干凈的手術(shù)刀切下含目的基因的瓊脂糖凝膠塊， 放 入已稱重的離心管中， 在保證目的基因全部回收的同時， 應(yīng)盡量減少 膠的體積。ii. 計算凝膠重量（100 mg相當(dāng)于 100 l ），加入 3倍

10、體積 solution DE-A， 75水浴 6-8 分鐘，其間輕柔地顛倒離心管至膠完全融化。iii. 加入 2 倍體積 solution DE-B，顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中， 室溫放置 1 min，12000 rpm離心 1 min。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入 600 l Wash solution，室 溫 12000 rpm 離心 30 s。v. 重復(fù)步驟一次。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫 12000 rpm離心 1 min。vii. 將吸附柱放入新的 1.5 mL 滅菌離心管中，在柱膜中央加入 30 l 75預(yù)熱的 ddH2O，室溫放置 2 min

11、，12000 rpm離心 1 min。離心 管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20備用。 表達(dá)載體酶切大片斷和目的基因的連接（根據(jù)連接酶說明書方法操作）連接反應(yīng)體系反應(yīng)液成分體積10T4 Buffer2.5 lddH2O15.5 lpET30c大片段2 lSTS(saIl/xhoI)4 lT4 Ligase1 lTotal25 l16過夜連接。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli 宿主菌（根據(jù)表達(dá)載體確定） （熱擊法） 連接產(chǎn)物加至感受態(tài) E.coli DH52（200ul）或（ 100ul） 【非連接載 體加 2ul】 【加入后離火遠(yuǎn)點輕輕用手撥】冰上放置 20min42水浴熱

12、擊 90s立即放置冰上 2min（勿震蕩）于超凈工作臺加 800ul LB 培養(yǎng)液37， 150rpm 預(yù)培養(yǎng) 50min6000rpm離心 1min，吸除 800ul 上清；剩余液體用來懸浮沉淀涂布 LB+Amp 平板上， 37倒置培養(yǎng) 12h（于超凈工作臺吹干液體） 轉(zhuǎn)化菌的 PCR 鑒定（菌落 PCR） 轉(zhuǎn)化菌的酶切鑒定：轉(zhuǎn)化菌菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切檢測。酶切反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù)內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。酶 切產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠分離。菌種保存取 500 l 重組菌液加入等體積 50%的無菌甘油 （終濃度達(dá)到 25%），液 氮速凍， -80保存。 . 目的基因在 E

13、. coli 表達(dá)載體宿主菌內(nèi)的表達(dá)SDS-PAGE蛋白膠配制上層膠（ 3%）下層膠（ 12%）下層膠（10%） 下層膠 （7.5%）ddH2O1.085 mL1.5 mL1.85 mL2.25 mL上層膠緩沖液0.625 mL上層膠儲備液0.75 mL下層膠緩沖液1.25 mL1.25 mL1.25 mL下層膠儲備液2 mL1.65 mL1.25 mL20% SDS12.5 l25 l25 l25 l10%過硫酸銨(AP) 25 l50 l50 l50 lTEMED5 l7 l2 l7 lTotal 2.5 mL 5 mL 5 mL 5 mL在實驗中，試用了不同濃度的下層膠，以獲得最佳分離效

14、果。 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（ 這個不確定 ）i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的 LB 平板上劃線培養(yǎng)過夜。ii. 次日，挑取單克隆，接種到 5 mL 含對應(yīng)抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37， 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液 100 l 加入到 10 mL LB 培養(yǎng)基中 （1: 100）， 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 h 左右至 OD600=0.6。iv. 培養(yǎng)完畢后，取 1 mL 菌液 12000 rpm離心，棄上清， 200 l PBS懸 浮。在剩余 9 mL 菌液中加 100 mmol/L IPTG 54 l 至終濃度 0.6 mmol/L ，此時記為

15、 0 h。v. 此后分別在 1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，9 h 各取 1 mL 菌液，12000 rpm 離心，棄上清， 200 l PBS 重懸。加 2Loading buffer 后沸水 變性 5 min。vi. SDS-PAGE 檢測蛋白表達(dá)。 檢測重組蛋白可溶性（ 好像做多克隆抗體不用檢測蛋白可溶性？ ）i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的 LB 平板上劃線培養(yǎng)過夜。ii. 次日，挑取單克隆，接種到 5 mL 含對應(yīng)抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37， 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液 100 l 加入到 10 mL LB 培養(yǎng)基中 (1: 100)， 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 h 左右至 OD600=0.6。iv. 加入 IPTG誘導(dǎo)至 6 h，4，10000 g離心 5 min。v. 去上