蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義

1、蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 若溶液中存在變性劑（酸、堿、鹽酸胍、若溶液中存在變性劑（酸、堿、鹽酸胍、 尿素、重金屬、某些有機(jī)試劑等）能引起蛋白尿素、重金屬、某些有機(jī)試劑等）能引起蛋白 質(zhì)變性。質(zhì)變性。 弱變性條件下，蛋白質(zhì)部分變性，肽鏈保弱變性條件下，蛋白質(zhì)部分變性，肽鏈保 持一定構(gòu)型；強(qiáng)變性條件下，蛋白質(zhì)完全變性持一定構(gòu)型；強(qiáng)變性條件下，蛋白質(zhì)完全變性 肽鏈伸展成無序隨機(jī)狀態(tài)。肽鏈伸展成無序隨機(jī)狀態(tài)。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 變性過程伴隨著蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)、生物學(xué)變性過程伴隨著蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)、生物學(xué) 性質(zhì)的變化，如溶解度改變、體積變大、黏度性質(zhì)的變化，如溶解度改變、體積變大、黏度 增加、擴(kuò)散系

2、數(shù)降低、生物活性降低或消失等。增加、擴(kuò)散系數(shù)降低、生物活性降低或消失等。 蛋白質(zhì)變性時(shí)肽鏈伸展而失去特定的空間蛋白質(zhì)變性時(shí)肽鏈伸展而失去特定的空間 結(jié)構(gòu)，稱為肽鏈的伸展或去折疊。結(jié)構(gòu)，稱為肽鏈的伸展或去折疊。 許多變性蛋白質(zhì)在去除變性因素后，可自許多變性蛋白質(zhì)在去除變性因素后，可自 發(fā)地恢復(fù)它原來的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這稱發(fā)地恢復(fù)它原來的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這稱 為變性蛋白質(zhì)的再折疊或復(fù)性。為變性蛋白質(zhì)的再折疊或復(fù)性。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 作用力可分為四種主要類型：作用力可分為四種主要類型： 疏水相互作用疏水相互作用 多肽鏈處于水環(huán)境時(shí)，其非極性側(cè)鏈基團(tuán)為避開多肽鏈處于

3、水環(huán)境時(shí)，其非極性側(cè)鏈基團(tuán)為避開 極性分子而形成疏水核心，是極性分子而形成疏水核心，是“疏水折疊疏水折疊”。 氫鍵氫鍵 蛋白質(zhì)內(nèi)有非常多的氫鍵，不同氫鍵對蛋白質(zhì)構(gòu)蛋白質(zhì)內(nèi)有非常多的氫鍵，不同氫鍵對蛋白質(zhì)構(gòu) 象的影響大小也不同，至少在二級結(jié)構(gòu)，如象的影響大小也不同，至少在二級結(jié)構(gòu)，如-螺旋螺旋 和和-折疊的形成與維系起重要作用。折疊的形成與維系起重要作用。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 鹽鍵鹽鍵 多肽鏈上的眾多帶正負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)之間或與環(huán)境多肽鏈上的眾多帶正負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)之間或與環(huán)境 中的正負(fù)離子之間的靜電作用對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有較中的正負(fù)離子之間的靜電作用對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有較 大影響，在蛋白質(zhì)構(gòu)象形

4、成過程中也起到重要作用。大影響，在蛋白質(zhì)構(gòu)象形成過程中也起到重要作用。 二硫鍵二硫鍵 是側(cè)鏈基團(tuán)之間唯一的共價(jià)鍵，對蛋白質(zhì)天然構(gòu)是側(cè)鏈基團(tuán)之間唯一的共價(jià)鍵，對蛋白質(zhì)天然構(gòu) 象及折疊過程中形成的中間體具有很強(qiáng)的穩(wěn)定作用，象及折疊過程中形成的中間體具有很強(qiáng)的穩(wěn)定作用， 在蛋白質(zhì)折疊過程中起到關(guān)鍵作用。在蛋白質(zhì)折疊過程中起到關(guān)鍵作用。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 在在E.coli細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高水平表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高水平表達(dá)的外源蛋白質(zhì)， 尤其是來自真核生物的蛋白質(zhì)聚集，會形成不溶尤其是來自真核生物的蛋白質(zhì)聚集，會形成不溶 性、無生物活性的聚合物性、無生物活性的聚合物-包涵體。包涵體。 E.coli包

5、涵體包涵體 大腸桿菌中的胰乳酶原包含體電鏡照片大腸桿菌中的胰乳酶原包含體電鏡照片 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 包涵體形成原因：包涵體形成原因： 使用高計(jì)量基因和強(qiáng)啟動子；使用高計(jì)量基因和強(qiáng)啟動子； 大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)環(huán)境條件，如大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)環(huán)境條件，如pH、離子強(qiáng)度、高還原、離子強(qiáng)度、高還原 電位，不同于外源蛋白質(zhì)正確折疊為最終構(gòu)象條件；電位，不同于外源蛋白質(zhì)正確折疊為最終構(gòu)象條件； 缺少蛋白質(zhì)正確折疊的輔助因子。如催化構(gòu)象互變的缺少蛋白質(zhì)正確折疊的輔助因子。如催化構(gòu)象互變的 折疊酶，脯氨?；樥郫B酶，脯氨?；?反異構(gòu)酶，二硫鍵異構(gòu)酶，及增反異構(gòu)酶，二硫鍵異構(gòu)酶，及增 強(qiáng)折疊或阻止聚集的分子伴侶等。

6、強(qiáng)折疊或阻止聚集的分子伴侶等。 超表達(dá)產(chǎn)生的高濃度新生蛋白質(zhì)由于多肽鏈不完全折超表達(dá)產(chǎn)生的高濃度新生蛋白質(zhì)由于多肽鏈不完全折 疊，有利于分子疏水序列之間的相互作用，最終導(dǎo)致疊，有利于分子疏水序列之間的相互作用，最終導(dǎo)致 這些蛋白質(zhì)的聚集和錯(cuò)誤折疊。這些蛋白質(zhì)的聚集和錯(cuò)誤折疊。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 有利方面：有利方面： 蛋白質(zhì)表達(dá)量高；蛋白質(zhì)表達(dá)量高； 抗剪切和較高溫度，對破碎細(xì)胞方法和條件要求低；抗剪切和較高溫度，對破碎細(xì)胞方法和條件要求低； 包涵體密度大，易分離；包涵體密度大，易分離； 包涵體的蛋白質(zhì)純度較高；包涵體的蛋白質(zhì)純度較高； 后續(xù)蛋白質(zhì)分離純化較容易。后續(xù)蛋白質(zhì)分離純化較容易。

7、不利方面：不利方面： 需變性復(fù)性；需變性復(fù)性； 活性蛋白質(zhì)收率低?；钚缘鞍踪|(zhì)收率低。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 要分離具有活性的蛋白質(zhì)，要經(jīng)歷下列步驟：要分離具有活性的蛋白質(zhì)，要經(jīng)歷下列步驟： 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞分離出包含體分離出包含體溶解包含體溶解包含體目目 標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原。標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原。 破碎細(xì)胞，可耐受較高溫度和破碎條件；破碎細(xì)胞，可耐受較高溫度和破碎條件； 離心沉淀包涵體，離心力較低，除去碎片；離心沉淀包涵體，離心力較低，除去碎片； 洗滌包涵體，包涵體的目的蛋白質(zhì)含量為洗滌包涵體，包涵體的目的蛋白質(zhì)含量為80% 左右，左右， 含有酯類，蛋白，可用含低濃度的變性劑，如尿素、含有酯類，蛋白

8、，可用含低濃度的變性劑，如尿素、 鹽酸胍、鹽酸胍、Triton X-100反復(fù)洗滌，黏度高時(shí)可用溶菌酶、反復(fù)洗滌，黏度高時(shí)可用溶菌酶、 稀稀NaOH溶液洗滌，獲得較純的包涵體。溶液洗滌，獲得較純的包涵體。 目標(biāo)產(chǎn)物的復(fù)原目標(biāo)產(chǎn)物的復(fù)原 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 包涵體的溶解包涵體的溶解 包涵體的溶解需要打斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間包涵體的溶解需要打斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間 的共價(jià)鍵（二硫鍵）、離子鍵、疏水作用及靜電作的共價(jià)鍵（二硫鍵）、離子鍵、疏水作用及靜電作 用等，使多肽鏈伸展。用等，使多肽鏈伸展。 包涵體的溶解需要強(qiáng)的變性劑，如尿素、鹽酸包涵體的溶解需要強(qiáng)的變性劑，如尿素、鹽酸 胍或硫氰酸鹽，或表面

9、活性劑，如胍或硫氰酸鹽，或表面活性劑，如SDS、十六烷基三、十六烷基三 甲基銨氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸鈉等；甲基銨氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸鈉等； 對于含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑，如對于含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑，如 巰基乙醇、二硫基蘇糖醇巰基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)、二硫基赤蘚糖醇、二硫基赤蘚糖醇、 谷胱甘肽等使谷胱甘肽等使S- S鍵斷裂。鍵斷裂。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 包涵體的溶解包涵體的溶解 溫度一般溫度一般2530，以促進(jìn)溶解。，以促進(jìn)溶解。 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的包涵體，可采用原位溶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的包涵體，可采用原位溶 解法。即在發(fā)酵結(jié)束時(shí)向培養(yǎng)基中加入變

10、性解法。即在發(fā)酵結(jié)束時(shí)向培養(yǎng)基中加入變性 劑和還原劑，在堿性條件下進(jìn)行包涵體原位劑和還原劑，在堿性條件下進(jìn)行包涵體原位 溶解（增加細(xì)胞膜的通透性，使包涵體溶解溶解（增加細(xì)胞膜的通透性，使包涵體溶解 出來），再采用雙水相萃取除去細(xì)胞碎片，出來），再采用雙水相萃取除去細(xì)胞碎片， 獲得包涵體溶解液。獲得包涵體溶解液。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性 復(fù)性：就是脫除變性劑使溶解的包涵體蛋復(fù)性：就是脫除變性劑使溶解的包涵體蛋 白質(zhì)的伸展肽鏈折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)。白質(zhì)的伸展肽鏈折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)。 在復(fù)性過程中，處于伸展?fàn)顟B(tài)的肽鏈，因暴在復(fù)性過程中，處于伸展?fàn)顟B(tài)的肽鏈，因暴 露在外面的疏

11、水側(cè)鏈基團(tuán)之間的相互作用而露在外面的疏水側(cè)鏈基團(tuán)之間的相互作用而 使這些分子很容易發(fā)生聚集反應(yīng)，形成沉淀，使這些分子很容易發(fā)生聚集反應(yīng)，形成沉淀， 這是大多數(shù)蛋白質(zhì)復(fù)性率低的主要原因。這是大多數(shù)蛋白質(zhì)復(fù)性率低的主要原因。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性過程及聚集體的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性過程及聚集體的產(chǎn)生 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 圖圖3-15 大腸桿菌胞質(zhì)中大腸桿菌胞質(zhì)中 蛋白復(fù)性的一般過程蛋白復(fù)性的一般過程 (a)(a)直接表達(dá)產(chǎn)物：直接表達(dá)產(chǎn)物： ，細(xì)胞裂解，包含體，細(xì)胞裂解，包含體 分離；分離； ，變性；，再折疊。，變性；，再折疊。 圖中代表具有二硫鍵的圖中

12、代表具有二硫鍵的 情形，代表情形，代表H H或或- - SOSO3 3- -；(b)(b)融合蛋白：，融合蛋白：， 同同(a)(a)，釋放重，釋放重 組肽鏈；，再折疊。組肽鏈；，再折疊。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性 目前發(fā)展的復(fù)性方法：目前發(fā)展的復(fù)性方法： 稀釋復(fù)性稀釋復(fù)性 透析、透濾復(fù)性透析、透濾復(fù)性 色譜法復(fù)性：色譜法復(fù)性： 凝膠過濾色譜復(fù)性、凝膠過濾色譜復(fù)性、 離子交換色譜復(fù)性離子交換色譜復(fù)性 、 親合色譜復(fù)性親合色譜復(fù)性 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性 一個(gè)有效、理想的折疊復(fù)性方法具備的特點(diǎn)：一個(gè)有效、理想的折疊復(fù)性方法具備的特點(diǎn)： 活性蛋白質(zhì)回收率

13、高；活性蛋白質(zhì)回收率高； 正確復(fù)性產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離；正確復(fù)性產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離； 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品； 折疊復(fù)性方法易放大；折疊復(fù)性方法易放大； 復(fù)性過程耗時(shí)少。復(fù)性過程耗時(shí)少。 要求折疊復(fù)性過程快速、低成本、高效。要求折疊復(fù)性過程快速、低成本、高效。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 從細(xì)胞破碎到蛋白質(zhì)復(fù)性不同的工藝路線：從細(xì)胞破碎到蛋白質(zhì)復(fù)性不同的工藝路線： 機(jī)械破碎機(jī)械破碎(高壓勻漿，高速珠磨高壓勻漿，高速珠磨)離心法提離心法提 取包含體取包含體加變性劑溶解加變性劑溶解除變性劑復(fù)性；除變性劑復(fù)性； 路線利用包含體與細(xì)胞碎片

14、的密度差，用離路線利用包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離 心將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，使心將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，使 分離純化簡單。缺點(diǎn)：經(jīng)過幾次離心才能除去大分離純化簡單。缺點(diǎn)：經(jīng)過幾次離心才能除去大 部分細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長。部分細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 機(jī)械破碎機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白膜分離除可溶性蛋白變變 性劑溶解包含體性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性；除變性劑復(fù)性； 路線應(yīng)用膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶路線應(yīng)用膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶 性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋 住，難以分開；而且膜的堵塞

15、和濃差極化常住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常 常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。優(yōu)點(diǎn)：封閉式常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。優(yōu)點(diǎn)：封閉式 操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消 耗也比離心法少。耗也比離心法少。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 化學(xué)破碎化學(xué)破碎(加變性劑加變性劑)離心除細(xì)胞碎離心除細(xì)胞碎 片片除變性劑復(fù)性。除變性劑復(fù)性。 路線是用化學(xué)法破菌，所采用的試劑路線是用化學(xué)法破菌，所采用的試劑 既可以破菌又可以溶解包含體，將兩道既可以破菌又可以溶解包含體，將兩道 工序合為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間。缺工序合為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間。缺 點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒有被除去，

16、點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒有被除去， 混雜在產(chǎn)物中間，給后分離帶來困難。混雜在產(chǎn)物中間，給后分離帶來困難。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 伸展蛋白質(zhì)分子的聚集反應(yīng)是兩個(gè)分子或多伸展蛋白質(zhì)分子的聚集反應(yīng)是兩個(gè)分子或多 個(gè)分子之間的反應(yīng)，屬于二級以上動力學(xué)反個(gè)分子之間的反應(yīng)，屬于二級以上動力學(xué)反 應(yīng)，而正確折疊反應(yīng)是單個(gè)蛋白質(zhì)分子的自應(yīng)，而正確折疊反應(yīng)是單個(gè)蛋白質(zhì)分子的自 我組裝過程，屬于一級動力學(xué)反應(yīng)。我組裝過程，屬于一級動力學(xué)反應(yīng)。 聚集反應(yīng)與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系更大。在低濃聚集反應(yīng)與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系更大。在低濃 度進(jìn)行復(fù)性有利于控制聚集反應(yīng)。度進(jìn)行復(fù)性有利于控制聚集反應(yīng)。 通常，復(fù)性的蛋白質(zhì)濃度為通常，復(fù)

17、性的蛋白質(zhì)濃度為1050g/mL。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 操作方式：操作方式： 1、一次性稀釋：、一次性稀釋： 2、分段稀釋：一般采用兩步法，先將變性、分段稀釋：一般采用兩步法，先將變性 劑濃度降低到一中間濃度，最后再完全除去。劑濃度降低到一中間濃度，最后再完全除去。 3、連續(xù)稀釋：變性蛋白質(zhì)溶液與復(fù)性溶液、連續(xù)稀釋：變性蛋白質(zhì)溶液與復(fù)性溶液 按一定比例連續(xù)混合，復(fù)性。按一定比例連續(xù)混合，復(fù)性。 分段和連續(xù)稀釋法復(fù)性回收率高于一次性分段和連續(xù)稀釋法復(fù)性回收率高于一次性 稀釋稀釋 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 稀釋復(fù)性應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的問題：稀釋復(fù)性應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的問題： 復(fù)性緩沖液量大，體積大，設(shè)備

18、利用率低；復(fù)性緩沖液量大，體積大，設(shè)備利用率低； 蛋白質(zhì)濃度低，產(chǎn)物回收困難；蛋白質(zhì)濃度低，產(chǎn)物回收困難； 稀釋復(fù)性法是其他復(fù)性法的基礎(chǔ)。稀釋復(fù)性法是其他復(fù)性法的基礎(chǔ)。 對一個(gè)新的包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)，首選的方法對一個(gè)新的包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)，首選的方法 是稀釋復(fù)性法。是稀釋復(fù)性法。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制 復(fù)性中最重要的是抑制復(fù)性過程的聚集反應(yīng)。復(fù)性中最重要的是抑制復(fù)性過程的聚集反應(yīng)。 最常用的是使用聚集反應(yīng)的抑制劑，其原理：最常用的是使用聚集反應(yīng)的抑制劑，其原理： 穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)， 降低錯(cuò)誤折疊蛋白

19、質(zhì)的穩(wěn)定性，降低錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性， 增加折疊復(fù)性中間體的溶解度，增加折疊復(fù)性中間體的溶解度， 增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解度，增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解度， 減少復(fù)性中間體接觸發(fā)生聚集反應(yīng)。減少復(fù)性中間體接觸發(fā)生聚集反應(yīng)。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制 聚集反應(yīng)抑制劑的種類：聚集反應(yīng)抑制劑的種類： 可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍 或尿素。在非變性濃度下，是有效的促進(jìn)劑?；蚰蛩亍Ｔ诜亲冃詽舛认?，是有效的促進(jìn)劑。 Zn2+ 和和Cu2+可穩(wěn)定折疊中間體?？煞€(wěn)定折疊中間體。 PEG促進(jìn)折疊復(fù)性，促進(jìn)折疊復(fù)性，

20、PEG與復(fù)性中間體特異形成與復(fù)性中間體特異形成 非聚集的復(fù)合物，阻止復(fù)性時(shí)疏水中間體的聚非聚集的復(fù)合物，阻止復(fù)性時(shí)疏水中間體的聚 集，復(fù)合物折疊形成第二個(gè)中間體，并不再與集，復(fù)合物折疊形成第二個(gè)中間體，并不再與 PEG結(jié)合。結(jié)合。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)聚集反應(yīng)的抑制 表面活性劑，尤其是離子型或兩性離子表面活性劑。表面活性劑，尤其是離子型或兩性離子表面活性劑。 如如 Triton X-100、磷脂、十二烷基麥芽糖苷、磺酸甜菜、磷脂、十二烷基麥芽糖苷、磺酸甜菜 堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用。堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用。 多離子化合物，如肝素，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊

21、復(fù)性，多離子化合物，如肝素，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性， 且有穩(wěn)定蛋白質(zhì)天然構(gòu)型的作用。且有穩(wěn)定蛋白質(zhì)天然構(gòu)型的作用。 短鏈醇類、高滲物，如乙醇、甘油等對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定短鏈醇類、高滲物，如乙醇、甘油等對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定 作用，可有效降低低聚體的形成。作用，可有效降低低聚體的形成。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 稀釋法復(fù)性的缺點(diǎn)與改進(jìn)的方案稀釋法復(fù)性的缺點(diǎn)與改進(jìn)的方案 改進(jìn)的方案：改進(jìn)的方案： 膜透析復(fù)性膜透析復(fù)性 反膠束復(fù)性反膠束復(fù)性 固相輔助復(fù)性固相輔助復(fù)性 稀釋法的缺點(diǎn)： 濃度低（ng/ml) 體積大（增大2040倍） 復(fù)性率低（常常20) 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 原理：變性劑均為小分子物質(zhì)，在透析或原理：變

22、性劑均為小分子物質(zhì)，在透析或 超濾時(shí)可逐漸透過多孔膜，使變性蛋白質(zhì)溶液超濾時(shí)可逐漸透過多孔膜，使變性蛋白質(zhì)溶液 的變性劑濃度逐漸降低，最后除去變性劑，使的變性劑濃度逐漸降低，最后除去變性劑，使 變性蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。變性蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。 包括借助超濾實(shí)現(xiàn)復(fù)性的透濾復(fù)性法。包括借助超濾實(shí)現(xiàn)復(fù)性的透濾復(fù)性法。 缺點(diǎn)：過程緩慢，耗時(shí)間長，效率低。缺點(diǎn)：過程緩慢，耗時(shí)間長，效率低。 對某些蛋白質(zhì)復(fù)性率高于稀釋復(fù)性法。對某些蛋白質(zhì)復(fù)性率高于稀釋復(fù)性法。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 在色譜過程中實(shí)現(xiàn)復(fù)性，稱為色譜復(fù)性法。優(yōu)點(diǎn)是：在色譜過程中實(shí)現(xiàn)復(fù)性，稱為色譜復(fù)性法。優(yōu)點(diǎn)是： 色譜固定相對變性蛋白質(zhì)吸附能力低，甚至

23、完全消除色譜固定相對變性蛋白質(zhì)吸附能力低，甚至完全消除 變性蛋白質(zhì)在脫離變性劑的環(huán)境發(fā)生聚集，產(chǎn)生沉淀。變性蛋白質(zhì)在脫離變性劑的環(huán)境發(fā)生聚集，產(chǎn)生沉淀。 提高復(fù)性質(zhì)量和活性收率。提高復(fù)性質(zhì)量和活性收率。 在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)可使目的蛋白質(zhì)與雜蛋白質(zhì)分離，在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時(shí)可使目的蛋白質(zhì)與雜蛋白質(zhì)分離， 達(dá)到復(fù)性與純化同時(shí)進(jìn)行的目的。達(dá)到復(fù)性與純化同時(shí)進(jìn)行的目的。 便于回收變性劑，有利于降低廢水處理成本。便于回收變性劑，有利于降低廢水處理成本。 方法：凝膠過濾色譜方法：凝膠過濾色譜(GFC)、離子交換色譜、離子交換色譜(IEC)、親、親 合色譜合色譜(AFC). 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 洗滌液洗脫液

24、 層析（色譜）復(fù)性的一般操作 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 色譜法復(fù)性過程的示意圖色譜法復(fù)性過程的示意圖 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 凝膠過濾色譜是以溶液中分子的流體力學(xué)體凝膠過濾色譜是以溶液中分子的流體力學(xué)體 積大小進(jìn)行混合物分離的技術(shù)。物料在色譜柱積大小進(jìn)行混合物分離的技術(shù)。物料在色譜柱 中的保留體積不會超出色譜柱中的溶劑的總體中的保留體積不會超出色譜柱中的溶劑的總體 積，保留時(shí)間短，溶質(zhì)峰相對較窄，容易檢出，積，保留時(shí)間短，溶質(zhì)峰相對較窄，容易檢出， 靈敏度高。能夠把握間隔進(jìn)料的時(shí)間，進(jìn)行色靈敏度高。能夠把握間隔進(jìn)料的時(shí)間，進(jìn)行色 譜柱的連續(xù)使用，提高使用效率。譜柱的連續(xù)使用，提高使用效率。 蛋白質(zhì)分

25、子大，先從柱子上洗脫，變性劑分子蛋白質(zhì)分子大，先從柱子上洗脫，變性劑分子 小，最后流出色譜柱。達(dá)到復(fù)性目的。小，最后流出色譜柱。達(dá)到復(fù)性目的。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 原理：是利用配體與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的特異親原理：是利用配體與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的特異親 合作用，使變性蛋白質(zhì)分子保留在柱的頂端合作用，使變性蛋白質(zhì)分子保留在柱的頂端 與變性劑分離，而后在洗脫過程中進(jìn)行復(fù)性。與變性劑分離，而后在洗脫過程中進(jìn)行復(fù)性。 依使用的配體，用于復(fù)性的親合色譜有：依使用的配體，用于復(fù)性的親合色譜有： 抗體親合色譜、金屬親合色譜抗體親合色譜、金屬親合色譜(IMAC)、 脂質(zhì)體親合色譜和分子伴侶親合色譜等。脂質(zhì)體親合色譜

26、和分子伴侶親合色譜等。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 脂質(zhì)體親合色譜復(fù)性脂質(zhì)體親合色譜復(fù)性 脂質(zhì)體作為配體用于蛋白質(zhì)復(fù)性的原理是：脂質(zhì)體作為配體用于蛋白質(zhì)復(fù)性的原理是： 局部變形的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)類似于融球狀態(tài)，與局部變形的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)類似于融球狀態(tài)，與 具有天然蛋白質(zhì)相似的二級結(jié)構(gòu)，此時(shí)，蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)相似的二級結(jié)構(gòu)，此時(shí)，蛋白質(zhì) 分子仍然具有強(qiáng)的疏水表面，可同脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子仍然具有強(qiáng)的疏水表面，可同脂質(zhì)體的脂質(zhì) 雙層作用，以幫助蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性。雙層作用，以幫助蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 分子伴侶親合色譜，又稱為分子伴侶親合色譜，又稱為“折疊色譜折疊色譜”。

27、 為變性蛋白質(zhì)提供一個(gè)中空環(huán)狀的疏水腔，當(dāng)為變性蛋白質(zhì)提供一個(gè)中空環(huán)狀的疏水腔，當(dāng) 變性蛋白質(zhì)進(jìn)入空腔后，可部分避免或完全消變性蛋白質(zhì)進(jìn)入空腔后，可部分避免或完全消 除變性蛋白質(zhì)分子間的聚集作用，使蛋白質(zhì)在除變性蛋白質(zhì)分子間的聚集作用，使蛋白質(zhì)在 疏水環(huán)境中進(jìn)行疏水環(huán)境中進(jìn)行“結(jié)合結(jié)合-釋放釋放-再結(jié)合再結(jié)合”的循環(huán)的循環(huán) 過程，直到恢復(fù)其天然的構(gòu)象狀態(tài)。過程，直到恢復(fù)其天然的構(gòu)象狀態(tài)。 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性意義 原理：變性蛋白質(zhì)、變性劑及變性液中的其原理：變性蛋白質(zhì)、變性劑及變性液中的其 他組分與離子交換介質(zhì)間的電荷作用，使它他組分與離子交換介質(zhì)間的電荷作用，使它 們吸附在離子交換固定相表面，由于這些組們吸附在離子交換固定相表面，由于這些組 分與離子交換介質(zhì)的吸附能力的差別，在洗分與離子交換介質(zhì)的吸附能力的差別，在洗 脫過程中進(jìn)行不斷地吸附脫過程中進(jìn)行不斷地吸附-解吸解吸-再吸附的過程，再吸附的過程， 使變性蛋白質(zhì)與變性劑逐漸分離，并在吸附使變性蛋白質(zhì)與變性劑逐漸分離，并在吸附- 解吸的過程中進(jìn)行復(fù)性過程。解吸的過程中