真核生物基因表達(dá)調(diào)控[優(yōu)制材料]

1、Eukaryotic Gene Expression and Regulation 第八章第八章 真核基因表達(dá)調(diào)控真核基因表達(dá)調(diào)控 1相關(guān)知識 本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 1.1.基因表達(dá)與調(diào)控的基本概念與原理基因表達(dá)與調(diào)控的基本概念與原理 2.2.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(transcriptional regulation): : u DNA level (Genetic) u Chromatin level (Epigenetic) 3.3.轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(post-transcriptional regulation)： u RNA interference （ （

2、RNAi） ） u Protein degradation （ （Ubiquitin/proteasome） ） 2相關(guān)知識 第第 一一 節(jié)節(jié) 基本概念與原理基本概念與原理 Basic Concepts and Principles 3相關(guān)知識 Genome (cells repertoire of DNA) Transcriptome (cells repertoire of RNA transcripts) Proteome (cells repertoire of proteins) 單個基因單個基因 單個細(xì)胞單個細(xì)胞 中心法則中心法則 4相關(guān)知識 一、基因表達(dá)的概念一、基因表達(dá)的概念

3、基因組基因組(genome) 一個細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整一個細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整 套基因。套基因。 基因表達(dá)基因表達(dá)(gene expression) 基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功 能的能的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子或分子或RNA分子的過程。分子的過程。 基因表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation, or regulation of gene expression) 基因表達(dá)是受內(nèi)源及外源信號調(diào)控的。基因表達(dá)是受內(nèi)源及外源信號調(diào)控的。 5相關(guān)知識 Regulation of Gene Expression Chr

4、omatin epigenetic control RNA silencing Protein degradation 一般而言的基因表達(dá)調(diào)控范疇一般而言的基因表達(dá)調(diào)控范疇6相關(guān)知識 二、基因表達(dá)的時間性及空間性二、基因表達(dá)的時間性及空間性 （一）時間特異性（一）時間特異性 按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按 特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的時間時間 特異性特異性(temporal specificity)。 多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時間特異性又稱多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時間特異性又稱階階 段特異性段特異性(stage sp

5、ecificity)。 7相關(guān)知識 人體發(fā)育過程中不同類型人體發(fā)育過程中不同類型-珠蛋白的含量變化珠蛋白的含量變化 8相關(guān)知識 （二）空間特異性（二）空間特異性 基因表達(dá)伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分基因表達(dá)伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分 布差異，實際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，布差異，實際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的， 所以空間特異性又稱所以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性細(xì)胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。 在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體 按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達(dá)的按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表

6、達(dá)的 空間特異性空間特異性(spatial specificity)。 9相關(guān)知識 BARD1 is expressed specifically in the apical domains of Arabidopsis inflorescence (A), ovules (B), anthers (C), and embryos (D). In suit hybridization A, B, C, D: antisense BARD1 probe; E: sense BARD1 probe as a negative control. （朱玉賢第五章課件）（朱玉賢第五章課件） 10相關(guān)知識

7、 四種母源影響基因的四種母源影響基因的 mRNA和蛋白沿果蠅和蛋白沿果蠅 胚胎前胚胎前-后軸分布的后軸分布的 濃度變化圖濃度變化圖 protein BICOIDNANOS 第十章（基因和發(fā)育）第十章（基因和發(fā)育） mRNA 11相關(guān)知識 Facts Identical genome: Virtually every cell in an organism contains a complete set of genes Spatial specificity: But they are not all turned on in every cell or tissue Temporal spe

8、cificity: Each cell of an organism expresses a distinctive subset of genes at different time or developmental stage Tight regulation: During development different cells express different sets of genes in a precisely regulated fashion 12相關(guān)知識 三、基因表達(dá)的方式三、基因表達(dá)的方式 按對刺激的反應(yīng)性，基因表達(dá)的方式分為：按對刺激的反應(yīng)性，基因表達(dá)的方式分為： （

9、一）組成性表達(dá)（一）組成性表達(dá) (constitutive expression) 某些基因在一個個體的幾乎某些基因在一個個體的幾乎所有所有細(xì)胞中細(xì)胞中持持 續(xù)續(xù)表達(dá)，通常被稱為表達(dá)，通常被稱為管家基因管家基因(housekeeping gene)。 13相關(guān)知識 這類基因表達(dá)又稱為這類基因表達(dá)又稱為組成性基因表達(dá)組成性基因表達(dá) (constitutive gene expression)(constitutive gene expression)。 genes for essential cellular structures and metabolic pathways (e.g. rRN

10、A, actin, tubulin) usually expressed at high level the level of their gene expression may vary Housekeeping genes rRNA, actin, tubulin are commonly used as loading control in RT-PCR or Northern blot 14相關(guān)知識 （二）誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)（二）誘導(dǎo)和阻遏表達(dá) 在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激 活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘

11、導(dǎo)可誘導(dǎo) 基因基因 (inducible genes)。 如果基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答是被抑制，這種如果基因?qū)Νh(huán)境信號應(yīng)答是被抑制，這種 基因是基因是可阻遏基因可阻遏基因 (repressible genes)。 基因表達(dá)調(diào)控大多數(shù)是對這些基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控大多數(shù)是對這些基因的轉(zhuǎn) 錄和翻譯速率的調(diào)節(jié)錄和翻譯速率的調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致其編碼產(chǎn)從而導(dǎo)致其編碼產(chǎn) 物的水平發(fā)生改變，影響其功能。物的水平發(fā)生改變，影響其功能。 15相關(guān)知識 四、基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義四、基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義 （一）維持細(xì)胞增殖、分化（一）維持細(xì)胞增殖、分化 （二）維持個體生長、發(fā)育（二）維持個體生長、發(fā)育 （三）適應(yīng)環(huán)境變

12、化（三）適應(yīng)環(huán)境變化 第九、十章（基因與疾病、基因與發(fā)育）將要講到第九、十章（基因與疾病、基因與發(fā)育）將要講到 16相關(guān)知識 1. Transcripts （轉(zhuǎn)錄本） begin and end beyond the coding region (5UTR and 3UTR) 2. The primary transcript is processed by: 5 capping 3 formation / polyA splicing 3. Mature transcripts are transported to the cytoplasm for translation 一般而言，基因表

13、達(dá)調(diào)控主要是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄一般而言，基因表達(dá)調(diào)控主要是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄 水平上的調(diào)節(jié)，即：水平上的調(diào)節(jié)，即：mRNAmRNA合成的多少。合成的多少。 transcription 17相關(guān)知識 五、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基本要素五、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基本要素 （一）（一）RNARNA聚合酶聚合酶 (RNA Polymerase)(RNA Polymerase) （二）特異（二）特異DNADNA序列序列 ( (ciscis-acting elements)-acting elements) （三）調(diào)節(jié)蛋白（三）調(diào)節(jié)蛋白 ( (transtrans-acting factors)-acting factors) Ge

14、ne expression regulation at the level of DNA (transcriptional regulation) -highly sequence-dependent -varied regulation for different genes 18相關(guān)知識 cis-acting elements: promoters/regulatory sequences of genes trans-acting factors: proteins and RNAs that bind cis-elements and promote or repress gene e

15、xpression 19相關(guān)知識 ( (一一) RNA) RNA聚合酶聚合酶 啟動子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過啟動子、調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過DNA-DNA-蛋白質(zhì)相互作蛋白質(zhì)相互作 用、蛋白質(zhì)用、蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)相互作用影響蛋白質(zhì)相互作用影響RNARNA聚合酶活性。聚合酶活性。 RNARNA PolPol I:I: rRNA,rRNA, 相對活性相對活性50-70%50-70% RNARNA PolPol IIII: : mRNAmRNA, ,相對活性相對活性20-40%20-40% RNA Pol III: tRNA,RNA Pol III: tRNA,相對活性相對活性10%10% RNA

16、Pol IV: small ncRNA,RNA Pol IV: small ncRNA,相對活性相對活性? 20相關(guān)知識 真核生物基因組中含有可以調(diào)控真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身自身基因表達(dá)活性的特異基因表達(dá)活性的特異DNADNA 序列，稱為序列，稱為順式作用元件順式作用元件 (cis-acting element)(cis-acting element)。 順式作用元件順式作用元件能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識別和結(jié)合，從而影能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識別和結(jié)合，從而影 響基因表達(dá)活性。響基因表達(dá)活性。 啟動子啟動子 (promoter)(promoter) 順式作用元件順式作用元件又分又分 增強

17、子增強子 (enhancer)(enhancer) 沉默子沉默子 (silencer)(silencer) En/SiPro DNA 編碼序列編碼序列 轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點 （二）特異（二）特異DNADNA序列序列 21相關(guān)知識 反式作用因子反式作用因子 (trans-acting factor) 能直接或間接與能直接或間接與順式作用元件順式作用元件相互作用，進而調(diào)控基相互作用，進而調(diào)控基 因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子反式作用因子。 按其功能不同，常有以下三類：按其功能不同，常有以下三類： 基本轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子 :識別識別promoter元件元件 轉(zhuǎn)

18、錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:識別識別enhancer或或silencer 共調(diào)節(jié)因子：不能進行共調(diào)節(jié)因子：不能進行DNA-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用 （三）真核基因的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白（三）真核基因的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白 22相關(guān)知識 RNA聚合酶聚合酶在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 pol TFHTAF TFF TAF TAF TFA TFB TBP TATA DNA TAF: TBP associated factors holoenzyme 1. 1. 基本轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子 (general transcription factor, GTF) 是指能夠

19、直接或間接與啟動子核心序列是指能夠直接或間接與啟動子核心序列TATATATA盒特異結(jié)合、盒特異結(jié)合、 并啟動轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。并啟動轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。 TBP: TATA-box binding protein TFII: pol II associated TF 23相關(guān)知識 2. 2. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 (transcription factor, TF) 這類調(diào)節(jié)蛋白能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點的上游序列和遠(yuǎn)這類調(diào)節(jié)蛋白能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點的上游序列和遠(yuǎn) 端的增強子元件，通過端的增強子元件，通過DNADNA蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。 決定不同基因

20、的時間、空間特異性表達(dá)決定不同基因的時間、空間特異性表達(dá). . 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptional activator) 轉(zhuǎn)錄阻遏因子轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptional repressor) 3. 3. 共調(diào)節(jié)因子共調(diào)節(jié)因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白蛋白相互作用，進而影響它首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白蛋白相互作用，進而影響它 們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性們的分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性, ,本身無本身無DNADNA結(jié)合活性。結(jié)合活性。 如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用共激活

21、因子；共激活因子； 與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用共阻遏因子。共阻遏因子。 24相關(guān)知識 常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域 (domain) DNA結(jié)合域結(jié)合域 （DNA binding domain) Basic AA (K/R) rich, positively charged 轉(zhuǎn)錄激活域轉(zhuǎn)錄激活域 (trans-activation domain) TF 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域蛋白質(zhì)結(jié)合域 （dimerization, co-factors） 谷氨酰胺谷氨酰胺(Q)(Q)富含域富含域 酸性激活域酸性激活域 (D/E-rich) 脯氨酸脯氨酸(P)富含域富含域

22、 25相關(guān)知識 Zinc Finger bHLH bZIP Homeodomain 1） TF最常見的最常見的DNA binding domain 26相關(guān)知識 (1) 鋅指鋅指(zinc finger) 常結(jié)合常結(jié)合GC box Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His C-terminal: -helix binding DNA 27相關(guān)知識 (2) 堿性亮氨酸拉鏈堿性亮氨酸拉鏈 bZIP 28相關(guān)知識 bHLHbHLH蛋白蛋白(basic Helix-Loop-Helix)(basic Helix-Loop-Helix) (3) 堿性螺旋堿性螺旋-

23、環(huán)環(huán)-螺旋螺旋bHLH 29相關(guān)知識 2） TF常見的常見的trans-activation domain 30相關(guān)知識 (Activation domain is interchangeable) 31相關(guān)知識 Interaction Assays Design of Two-hybrid / Three-hybrid /etc separable functional domains Two-hybrid assay (protein-protein) Tri-hybrid assay (protein-RNA) 32相關(guān)知識 1. RNA polymerase II 2. promote

24、r and enhancers 3. transcription factors Eukaryotic gene expression is usually controlled at the level of initiation of transcription. 真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 33相關(guān)知識 Holoenzyme - a supramolecular complex comprising Pol II, most GTFs, and Mediator/Srb complex In yeast, a 2MDa holoenzyme + TBP suffices

25、 for transcription Ordered Assembly and Pol II Holoenzyme TFIIDTFIID one-step multiple-step 34相關(guān)知識 TFIIB binds to DNA and contacts RNA polymerase near the RNA exit site and at the active center, and orients it on DNA. +25bp Q: prok -10bp vs euk -25bp? Sequential Assembly TBP: TATA binding protein TA

26、Fs: TBP associated factors Binding of TFIID (TBP + 11 TAFs, 800KD) to the TATA box is the first step in initiation. 35相關(guān)知識 CTD：RNA Pol II C-terminal domain CTD is an unusual extension appended to the C terminus of the largest subunit of RNA polymerase II. It comprises from 25 to 52 tandem copies of

27、the consensus repeat heptad Y1S2P3T4S5P6S7. S2 and S5 are major phosphorylation sites. CTD phosphorylation cause the conversion of proline isomerization states. Phosphorylation patterns on the CTD repeats determine different sets of associated factors, so that provide a dynamic platform to recruit d

28、ifferent regulators of the transcription apparatus. In eukaryotic cells, the transcription of genes is accurately orchestrated both spatially and temporally by the C-terminal domain of RNA polymerase II (CTD). 36相關(guān)知識 PIC: PhosphoS5 is required for assembly of the PIC and facilitates mRNA capping via

29、 recruitment of capping enzymes. Elongation: S5 gradually becomes dephosphorylated, whereas S2 is phosphorylated. Terminating: PhosphoS2 ensures efficient 3-RNA processing by triggering recruitment of 3-RNA processing machinery. Ending: CTDs are free of phosphate groups; non-phosphorylated CTDs are

30、required for RNA polymerase II to recycle and bind a promoter for the next cycle of transcription. S2 & S5, the trigger for transcriptional process modulation 37相關(guān)知識 38相關(guān)知識 Factors involved in gene expression include RNA polymerase and the basal apparatus, activators that bind directly to, co-activa

31、tors that bind to both activators and the basal apparatus, and regulators that act on chromatin structure (chromatin remodeling complex). Many Transcriptional Activators i.e. CAAT GC-box 39相關(guān)知識 Near the initiation site A little far away 40相關(guān)知識 SP1 stimulates transcription in presence of TAFII110 GC

32、boxes bound by DNA binding protein SP1 SP1 recruits TFIID by binding TAFII110 Partially reconstituted complex (TBP and 3 TAFs) in addition to other GTFs, Pol II leads to high levels of transcription SV40 early promoter Near 41相關(guān)知識 Mediator complex is targeted by an activator Mediator is a stable com

33、plex containing several proteins (20-50) Mediator binds to the RNA pol II and transcription factors (activators or repressors) and mediates the regulatory signals to pol II (中介復(fù)合體）中介復(fù)合體） Far 42相關(guān)知識 What is the mechanism of activation? Two models: 1.Tethering holoenzyme (recruitment) 2.Activating hol

34、oenzyme (allosteric) (interaction activation) ? 43相關(guān)知識 In favor of recruitment model（勾引模型勾引模型） 44相關(guān)知識 tat protein of HIV can stimulate transcription initiation without binding DNA at all The activating domain of the tat protein can stimulate transcription if it is tethered in the vicinity of promote

35、r by binding to the RNA product (tar sequence) of a previous round of transcription. tar tat 45相關(guān)知識 DNA-binding domain is to bring the activation domain into the vicinity of the startpoint. And activation is independent of the means of tethering. we can think of DNA-binding (or RNA-binding in the ca

36、se of tat) domain as providing a tethering function, whose main purpose is to ensure that the activation domain is in the vicinity of the initiation complex. The notion of tethering is a more general idea that initiation requires a high concentration of transcription factors in the vicinity of the p

37、romoter. This may be achieved when activators bind to enhancers, upstream promoter elements, or in an extreme case by tethering to a newly-made RNA product. 46相關(guān)知識 總結(jié)總結(jié) l 所有激活因子的共性：識別靶位點（啟動子、增強子）的特異性由 DNA結(jié)合域決定。 l DNA結(jié)合域?qū)⑥D(zhuǎn)錄激活域帶到基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域附近。 l 直接作用的激活因子具有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。 l 沒有轉(zhuǎn)錄激活域的激活因子可能與具有轉(zhuǎn)錄激活域的共激活因子一起 行使功

38、能。 l 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域中許多元件是（共）激活因子的靶位點 l RNA聚合酶可以和多種不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成全酶復(fù)合物行 使功能。 47相關(guān)知識 Synergy High levels of transcription induced by multiple factors Transcription factors can enhance transcription in a non-linear manner Synergisitic activation occurs due to multiple contacts with the machinery Multiple copie

39、s of the same activator also induce synergistic activation 48相關(guān)知識 Interferon enhancer Enhancers often have binding sites for several transcription factors Transcription factors can bind cooperatively at adjacent sites Architectural factors (with no regulatory domains, i.e. HMG1) can assist assembly

40、Remarkably increase binding affinity for both DNA and machinery 49相關(guān)知識 HMG1 肩并肩、手挽手，根基穩(wěn)、魅力足肩并肩、手挽手，根基穩(wěn)、魅力足 香肩并立、玉指緊扣，腳如磐石、面若桃花香肩并立、玉指緊扣，腳如磐石、面若桃花 50相關(guān)知識 One possible strategy: -Looping- Cohesins help to stabilize enhancer-promoter interactions How do enhancers act independent of distance and orienta

41、tion? 51相關(guān)知識 An enhancer may function by bringing proteins into the vicinity of the promoter. An enhancer does not act on a promoter at the opposite end of a long linear DNA, but becomes effective when the DNA is joined into a circle by a protein bridge. An enhancer and promoter on separate circular

42、 DNAs do not interact, but can interact when the two molecules are catenated. Two experiments support the looping model -The essential role of the enhancer is to increase the concentration of activator in the vicinity of the promoter- 52相關(guān)知識 Receptors for many steroid and thyroid hormones have a sim

43、ilar organization, with an individual N-terminal region, conserved DNA- binding region, and a C-terminal hormone-binding region Steroid receptors are transcription factors Zinc finger TF 53相關(guān)知識 Glucocorticoids regulate gene transcription by causing their receptor to transport into the nucleus and bi

44、nd to an enhancer whose action is needed for promoter function. Activation of Glucocorticoid Receptor (GR) Nuclear shuttling 54相關(guān)知識 利用利用GR的特性構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白系統(tǒng)的特性構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白系統(tǒng) Dexamethasone GR GR GR X X X Dexamethasone（DEX）: 地 塞米松,氟美松(抗炎藥)，合成 的一種糖皮質(zhì)激素； 通過分子克隆的方法將GR和要 研究的核蛋白X構(gòu)建成融合蛋 白，轉(zhuǎn)基因到酵母、動物細(xì)胞 或者植物中； 不施

45、加外源DEX時，融合蛋白 與HSP90形成復(fù)合物，由于構(gòu) 象和空間位阻等原因，融合蛋 白存在于胞質(zhì)中，不能定位到 細(xì)胞核； 添加DEX時，DEX擴散入胞與 GR相結(jié)合，融合蛋白改變構(gòu)象 后核定位信號暴露，即可入核 行使功能； 用以研究核蛋白的功能（包括 轉(zhuǎn)錄因子）。 55相關(guān)知識 Activation Tagging approach in plants Plant transformation 1. mutants screening 2. locate T-DNA insertion site in Arabidopsis genome (how?) 3. identify the rig

46、ht gene conferring mutant phenotype (how?) 構(gòu)建T-DNA序列，其中包括4倍重復(fù)的CaMV的35S增強字序 列，435S元件可以大大增強相鄰基因的轉(zhuǎn)錄； 通過轉(zhuǎn)基因的方法將T-DNA片段整合到植物基因組中； 植物基因組上與T-DNA插入位點相近的基因表達(dá)量增高，即 得到這個基因gain-of-function的轉(zhuǎn)基因植物； 56相關(guān)知識 XVELexA 的DNA結(jié)合域(X)VP16轉(zhuǎn)錄激活域(V)human estrogen receptor調(diào)控域(E) NPTII；轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記 OLexA-46：LexA操縱子CaMV 35S基本啟動子（而非增強子） A chemical-inducible activation tagging vector pER16 in plants RB-LB: T-DNA fragment (可以插入到基因組中) 其工作原理為：在G10-90啟動子控制下，XVE 融合轉(zhuǎn)錄因子組成型表 達(dá)；當(dāng)加入雌激素，雌激素和受體調(diào)控域（E）結(jié)合，導(dǎo)致XVE融合蛋 白