沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)

1、沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)1. 目的：保證CT DNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。2. 適用范圍：CT DNA的 TaqMan熒光定量檢測(cè)，標(biāo)本類型為分泌物。3 負(fù)責(zé)人： 操作人：4. 原理： 本試劑盒用一對(duì)沙眼衣原體特異引物和一條沙眼衣原體特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸 單體（dNTPS等成分，再用 PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)沙眼衣原體DNA5. 性能參數(shù)：檢出低值v 25基因拷貝/ml。6. 標(biāo)本要求：（ 1 ）標(biāo)本類型： 分泌物。（ 2）標(biāo)本采集： 見標(biāo)本采集手冊(cè)。（3）標(biāo)本儲(chǔ)存和運(yùn)輸：室溫放置不超過 8小時(shí)，4-8 C不超過72 小時(shí)，-20 C保存期6個(gè)月，

2、應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。（ 4）標(biāo)本拒收狀態(tài)： 細(xì)菌污染標(biāo)本不能作測(cè)定。7. 容器和添加劑類型： 無菌離心管和無菌試管。8. 所需設(shè)備： ABI GeneAmp 5700、臺(tái)式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4C、-20 C）、生物安全柜、紫外燈9. 試劑：DNA提取液（500卩1/管）2管；CT-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽 管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1 X 108基因拷貝/ml ） （50卩1/管） 1管；陰性質(zhì)控品（250卩1/管）1管。10.校準(zhǔn)程序（計(jì)量學(xué)溯源性）：送XXX市計(jì)量檢測(cè)所校準(zhǔn)11 程序步驟 : ：11.1 標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送男性：取尿道分泌物或細(xì)小棉拭子伸入快尿道約24c

3、m略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜） 。將分泌物或棉拭子置入無菌玻璃管，用無 菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。女性：陰道用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無菌 棉拭子插入宮頸內(nèi)，停 5 秒鐘后旋動(dòng)棉拭采取宮頸分泌物，將棉拭子置 入無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。尿道用無菌生理鹽水棉球洗凈尿道口，再用無菌棉拭子插入尿道約2cm,略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將棉拭子置入無菌玻璃 管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可保存于 -20 C待測(cè)，保存期為6個(gè)月。 標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 0 C冰壺。11.2 標(biāo)本及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的處理 標(biāo)本試管中加入 1ml 無菌生理鹽

4、水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至 1.5ml 離心管中 （如分泌物較多， 只取 0.2ml ） 12000rpm 離心 5 分鐘. 沉淀加無菌生理鹽水 1ml打勻,12000rpm離心5分鐘,再重復(fù)洗滌一次. 沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻，（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì),取 樣時(shí)需用加樣器充分混勻后吸取。 如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取 樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。 ） 沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），轉(zhuǎn)至4C靜置6-8小時(shí)以保證充 分裂解。12, 000rpm離心2分鐘，取上清液2ul做PCR反應(yīng)。另取陰陽 性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品各50ul加等量DNA提取液

5、打勻，沸水浴10分鐘后同上處 理。11.3GeneAmp5700操作取單管單人份 PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽 性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul，6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：ABI GeneAmp570（的循環(huán)條件：93C 2分鐘預(yù)變性，然后按 93C 45秒55 C 60秒，先做10個(gè)循環(huán)，最后93 C 30秒55 C 45秒，做30 個(gè)循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。11.4 結(jié)果分析條件的設(shè)定ABI GeneAmp570（的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根 據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) baseline 的 start 值 （24）,

6、stop 值（79） 以及 Threshold 值, 使陰性質(zhì)控品 Ct 值為 30, 臨界陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 Ct 值為 2224, 強(qiáng)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 Ct 值為 1820, 最后記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出 的 Ct 值.12 質(zhì)量控制程序：陰性質(zhì)控品：全部陰性陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性I r | 三 0.97（correlation 數(shù)值介于-0.97-1）; 108 至 104 基因拷貝/ml的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的定量值與理論值相比誤差小于土300%13 干擾： 標(biāo)本污染。14 生物參考區(qū)間： 正常人樣本為陰性或 0 基因拷貝 /ml 。15.患者檢驗(yàn)結(jié)果的可報(bào)告區(qū)間：Ct值40,實(shí)驗(yàn)樣本的CT DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml ） =M Ct值=40,樣品CT DNA含量25基因拷貝