核酸理化性質(zhì)和研究方法

1、本章小結(jié) 1. 核酸的基本結(jié)構(gòu)、核苷酸的組成成分 2. 核酸的一級結(jié)構(gòu) 3. DNA的高級結(jié)構(gòu)：二級、三級 Watson B. mRNA; C. 5S rRNA; D. 18S rRNA. 2. 與氨基酸結(jié)合的tRNA部位是_(12年36題) : A. 3末端; B. 5末端; C. N-末端 ; D. C-末端. 3. 下列核苷中，在真核生物tRNA和mRNA中都存在 的是_(12年24題) : A. 胸腺嘧啶核苷; B. 腺嘌呤核苷; C. 二氫尿嘧啶核苷 ; D. 假尿嘧啶核苷. 課程測驗 4. 一段雙鏈DNA包含1000個堿基對，其組成中 G+C=58%，那么該雙鏈DNA中T的含量是_

2、(10 年25題) : A. 58%; B. 42%; C. 29%; D. 21%. 5. 下列DNA模型中，屬于左手螺旋的是_(09年24 題) : A. Z-DNA; B. C-DNA; C. B-DNA ; D. A-DNA. 2016年10月6日，2014年諾貝爾獎生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 揭曉，擁有美英雙重國籍的科學(xué)家約翰奧基夫、 挪威科學(xué)家梅布里特莫澤和愛德華莫澤夫婦共 獲殊榮，以表彰他們對大腦“定位系統(tǒng)”的重大發(fā) 現(xiàn)。 2014諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 第十三章 核酸的理化性質(zhì)與 研究方法 一、核酸的理化性質(zhì)一、核酸的理化性質(zhì) 二、核酸的水解二、核酸的水解 三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸

3、收 四、核酸的變性復(fù)性與分子雜交四、核酸的變性復(fù)性與分子雜交 五、核酸的分離純化五、核酸的分離純化 六、核酸一級結(jié)構(gòu)測定六、核酸一級結(jié)構(gòu)測定 2015年農(nóng)學(xué)門類聯(lián)考考試大綱考點 (一) 核酸的種類和組成單位 (二) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 1DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三 級結(jié)構(gòu) 2RNA的分子結(jié)構(gòu)：tRNA的結(jié)構(gòu)、mRNA的結(jié)構(gòu)、 rRNA的結(jié)構(gòu) (三)核酸的理化性質(zhì) 1核酸的一般性質(zhì) 2核酸的紫外吸收特征 3核酸的變性及復(fù)性 (四)核酸的分離純化 DNA純品為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA純品則呈白色粉末或結(jié)晶。 溶解度： DNA和RNA微溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚 等有機

4、溶劑； 在分離核酸時，加入乙醇即可將其從溶液中沉淀出 來。 DNA和RNA的鈉鹽更易溶于水，如RNA鈉鹽在水 中的溶解度為4，分子量在106以上的DNA在水中 的溶解度達(dá)1以上時，成具粘性的膠體溶液 DNA和RNA在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 一、核酸的理化性質(zhì) 二、核酸的水解 堿基： 嘌 呤 堿 嘧 啶 堿 二、核酸的水解 1、酸水解 糖苷鍵比磷酸酯鍵更易水解，特別是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵很容 易水解。 2、堿水解 通常用于RNA水解，DNA的堿水解比較困難。 二、核酸的水解 3、酶促水解 酶的分類：酶的分類： 底物底物 （DNase/RNase） 作用方式作用方式: : 外切酶外切酶/

5、 /內(nèi)切酶內(nèi)切酶 鍵的打開方式：鍵的打開方式： 3-OH 5 -OH 核酸外切酶(exonuclease) 5-核苷3-核苷 核酸內(nèi)切酶(endonuclease) 核酸限制性內(nèi)切酶 一類專一識別特殊核苷酸序列 水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。 主要由細(xì)菌產(chǎn)生，如E. coli; 專一性極強高度特異的識別位點，這些位點通 常在4至8個堿基對范圍，且往往為回文結(jié)構(gòu); 切割后產(chǎn)生所謂粘性末端或平末端。 EcoR切割位點： N-C-T-T-A-A-G-N-5 5-N-G-A-A-T-T-C-N EcoRI 5 GAATTC 3 5 G AATTC 3 3 CTTAAG 5 3 CTTAA G 5 5 GGC

6、C 3 5 GG CC 3 3 CCGG 5 3 CC GG 5 HaeIII 限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué) 研究的重要研究的重要“工具酶工具酶”！ 三、核酸的紫外吸收 三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 紫外法測定核 酸含量的理論 基礎(chǔ)(260nm) A260/A280 = 1.8:純DNA A260/A280 = 2.0:純RNA 四、核酸的變性復(fù)性與分子雜交 核酸的變性(Denaturation)：指核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵斷裂，成為兩條 單鏈的過程。 核酸變性不涉及共價鍵(磷酸二酯鍵)的斷裂，而核酸鏈的磷酸二酯鍵斷裂稱 為核酸的降解。 引起變性的因素:如加熱、環(huán)境

7、體系氫離子濃度變化、脲素、胍等。 變性的核酸生物活性喪失。 DNA變性變性 增色效應(yīng)： 變性后的核酸，由于嘌呤堿基和嘧啶堿基的充分暴 露，在260nm處的光吸收能力明顯增加，此現(xiàn)象稱 增色效應(yīng)。 常用的使DNA變性的方法是加熱。 Tm值： 通常把增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度或DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱 為該DNA的熔解溫度或解鏈溫度，用Tm表示。 Tm = 69.3 + 0.41%G + C DNA的復(fù)性（的復(fù)性（renaturation） 復(fù)性: 變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下,彼 此分開的兩條鏈重新締合成為雙螺旋 的過程. 退火: 熱變性DNA在緩慢冷卻時可 以復(fù)性，冷卻的過程叫退火. 復(fù)

8、性后的DNA發(fā)生減色效應(yīng)，生物 活性恢復(fù)。 1、DNA的片段越大,復(fù)性 的速度越慢; 2、DNA的濃度越高,復(fù)性 的速度越快; 3、DNA的重復(fù)序列越多, 復(fù)性的速度越快; 4、溶液的pH過高或過低, 復(fù)性的速度均會降低; 5、適當(dāng)增高溶液的離子 強度,復(fù)性的速度會增高。 影響復(fù)性速度的因素： 核核 酸酸 的的 分分 子子 雜雜 交交 核酸的分子雜交 兩條來源不同但有互補關(guān)系的DNA 單鏈, 或DNA單鏈與RNA分子,在去 掉變性條件后互補的區(qū)段能夠退火 形成雙鏈DNA分子或DNA/RNA異質(zhì) 雙鏈的過程稱為分子雜交. Southern雜交：樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一 定大小的片段，進(jìn)行

9、變性凝膠電泳，將凝膠電泳 形成的DNA區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進(jìn)行雜交，這種技 術(shù)稱作。 Northern雜交：將RNA凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到 膜上再進(jìn)行雜交稱作。 Western印跡：將蛋白質(zhì)凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到 膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱為。 Eastern印跡：將蛋白質(zhì)等點聚焦形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到 膜上再與酶標(biāo)抗體進(jìn)行特異反應(yīng)稱作。 核酸的分子雜交 五、核酸的分離純化 策略： DNA的分離提取：防止剪切 RNA的分離提?。悍乐姑附?方法： 超速離心、柱層析、凝膠電泳 核酸的分離、提純和定量測定核酸的分離、提純和定量測定 1 1 DNADNA的分離的分離 用用1mol/L1mol/L的的Na

10、ClNaCl制備組織勻漿制備組織勻漿, ,離心除去組織殘渣離心除去組織殘渣, ,多次用苯酚處理多次用苯酚處理 使蛋白質(zhì)變性使蛋白質(zhì)變性, ,每次處理后離心取上層水相每次處理后離心取上層水相, ,最后加最后加2 2倍體積的乙醇沉淀倍體積的乙醇沉淀 出出DNADNA。 2 2 RNARNA的分離的分離 由于由于RNARNA酶存在廣泛酶存在廣泛, ,且十分穩(wěn)定且十分穩(wěn)定, ,破碎細(xì)胞時要加入胍鹽破壞破碎細(xì)胞時要加入胍鹽破壞RNARNA酶酶, , 試劑要用試劑要用0.1%0.1%的的DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）配制（焦碳酸二乙酯）配制, ,器皿要高壓滅菌或用器皿要高壓滅菌或用0.1%0.1% 的的

11、DEPCDEPC處理處理, ,多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性, ,每次處理后離心取上每次處理后離心取上 層水相層水相,mRNA,mRNA可用寡聚可用寡聚dT-dT-纖維素親和層析從總纖維素親和層析從總RNARNA中分離。中分離。 3 3 核酸含量的測定法核酸含量的測定法 常用的方法是測定常用的方法是測定260nm260nm的消光度的消光度, ,用公式計算核酸的含量。用公式計算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法測定。核酸的含量也可以用定磷法測定。 DNADNA的含量可以用二苯胺顯色法測定。的含量可以用二苯胺顯色法測定。 RNARNA的含量可以用地衣酚顯色法測

12、定。的含量可以用地衣酚顯色法測定。 4、核酸的超速離心、核酸的超速離心 超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大） ,線性DNA（密度 ?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。 5、核酸的凝膠電泳、核酸的凝膠電泳 松弛型，松弛型，OC, Open circular DNA 超螺旋超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNA 從細(xì)菌抽從細(xì)菌抽 提得到的提得到的 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA DNA 樣品中不樣品中不 含線狀含線狀 DNADNA 六、核酸一級結(jié)構(gòu)序列測定 1、 DNA的化學(xué)法測序 2、 DNA的酶法(末端終止法)測序 1、 DNA的化學(xué)法測序 2、 DNA

13、的酶法(末 端終止法)測序 一代測序 人類基因組計劃 1990年啟動、2000年完成，中國于1999年9月積極參加到 這項研究計劃中的，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體 短臂上約3000萬個堿基對的測序任務(wù)。 DNA測序新進(jìn)展 二代測序：大規(guī)模平行測序 454測序 、Illumina測序 三代測序：高通量、單分子測序 納米孔單分子 ，不需要進(jìn)行PCR擴增 本章小結(jié) 1. 名詞：核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、限制性內(nèi)切酶、增色效益、減色效益、變性、 復(fù)性、Tm值值、退火、分子雜交分子雜交 2. 核酸紫外吸收特點 3. 核酸的變性、復(fù)性與雜交 4. 核酸分離方法 課程測驗 1. 5末端通常具有帽子結(jié)

14、構(gòu)的RNA分子是_(08年 25題) : A.原核生物的mRNA; B. 原核生物的 rRNA; C. 真核生物的mRNA; D. 真核生物的 rRNA. 2. 真核生物mRNA中5末端的m7G與第二個核苷酸 之間的連接方式是_(09年23題) : A. 52; B. 53; C. 35; D. 55. 課程測驗 3. 現(xiàn)有純化的小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白溶液各 1瓶。簡要寫出根據(jù)核酸與蛋白質(zhì)紫外線吸收的特 征區(qū)分上述兩種物質(zhì)的實驗原理(12年40題) : 【答案要點】 實驗原理：DNA的最大光吸收峰在260nm附 近。蛋白質(zhì)在280nm附件有最大光吸收峰。 課程測驗 4. 用地衣酚法和雙縮

15、脲法可以鑒別酵母核糖核酸、 胰凝乳蛋白酶和半胱氨酸嗎？為什么？(13年40 題) : 【答案要點】 (1)可以。 (2)地衣酚法可以鑒別酵母核糖核酸，因為酵母核糖 核酸分子降解后與地衣酚反應(yīng)呈綠色；雙縮脲可 以鑒別胰凝乳蛋白，因為胰凝乳蛋白中含有肽鍵， 可以與雙縮脲試劑呈紫紅色；而Cys與二者均不反 應(yīng)。 課程測驗 1. 胸腺嘧啶除了在DNA中出現(xiàn)外，還出現(xiàn)在_(13 年34題) : A. tRNA; B. mRNA; C. 5S rRNA; D. 18S rRNA. 2. 與氨基酸結(jié)合的tRNA部位是_(12年36題) : A. 3末端; B. 5末端; C. N-末端 ; D. C-末端. 3. 下列核苷中，在真核生物tRNA和mRNA中都存在 的是_(12年24題) : A. 胸腺嘧啶核苷; B. 腺嘌呤核苷; C. 二氫尿嘧啶核苷 ; D. 假尿嘧啶核苷. 課程測驗 4. 一段雙鏈DNA包含1000個堿基對，其組成