博士學(xué)位研究生論文課題 中藥復(fù)方逆轉(zhuǎn)肝纖維化的實驗研究 開題報告(13P)

1、攻讀博（碩）士學(xué)位研究生論文課題開題報告書院（系、所） 教 研 室 專 業(yè) 中西醫(yī)結(jié)合臨床 研 究 方 向 中藥復(fù)方逆轉(zhuǎn)肝纖維化的實驗研究 研究生姓名 導(dǎo) 師 姓 名 導(dǎo) 師 職 稱 教 授 說 明一、本計劃書由研究生本人與導(dǎo)師共同協(xié)商填寫，要求字跡清楚，簡明扼要，條理清晰。二、本表一式三份，一份留學(xué)科點，一份留二級學(xué)院，一份送研究生部備案。三、計劃批準后非經(jīng)同樣手續(xù)不得隨意更改。參加課題的研究生導(dǎo)師及指導(dǎo)小組成員姓名、職稱、單位、簽字：姓 名職 稱工作單位（部門）簽 字導(dǎo)師簽名： 研究生簽名： 年 月 日 年 月 日 1研究課題名稱：軟肝寧煎劑治療大鼠肝纖維化的實驗研究研究課題的目的：本研究

2、通過軟肝寧煎劑對肝纖維化大鼠模型進行治療旨在觀察透明質(zhì)酸（ha）的含量及肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子（tgf-1）和病理學(xué)方面的改變探討中藥復(fù)方軟肝寧煎劑對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)作用。進一步揭示軟肝寧煎劑的作用機理，并為臨床篩選最佳治療方案提供可靠依據(jù)。選題的理論和實際意義 肝纖維化（hepatic fibrosis,hf）是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟中膠原蛋白等細胞外基質(zhì)（extracellluar matrix,ecm）的增生與降解失去平衡，進而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程，輕者稱為纖維化，重者進而使肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉及結(jié)節(jié)形成，稱為肝硬化。肝硬化致死人數(shù)僅次于肝硬化的人數(shù)僅次于惡

3、性腫瘤、心血管病、腦血管病和意外事故，居死亡原因第5位?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的病變，而肝硬化是不可逆轉(zhuǎn)的病變。慢性肝病發(fā)展到肝硬化甚至腹水時則各種治療難以奏效,西藥又無特效藥物,因此研究如何預(yù)防與治療肝纖維化成為當今醫(yī)學(xué)界的難題。中醫(yī)學(xué)認為,本病的病機為多屬嗜酒好醴或情志抑郁者 ,素常飲食不潔或常懷憤郁之氣 ,正氣內(nèi)虛 ,外感“濕熱毒邪”、“疫毒”、“蠱毒”等 ,外邪侵襲肝臟留而不去 ,阻滯肝經(jīng) ,肝脾不和 ,氣血不暢 ,終致氣滯血瘀 ,脈絡(luò)失養(yǎng) ,釀成瘀積之證。世界著名肝病專家hans popper曾說過：“誰能阻止或減慢肝纖維化的發(fā)生，將會治愈大多數(shù)慢性肝病患者”。因此如何逆轉(zhuǎn)

4、肝纖維化成為近年科學(xué)研究的重點，中醫(yī)藥抗纖維化更是研究的熱點。 2國內(nèi)外研究情況簡介：肝纖維化 (hepatic fibrosis)是由多種原因造成肝臟損傷 ,首先啟動炎性細胞 ,導(dǎo)致肝星狀細胞 (hsc)激活、增生、轉(zhuǎn)化和分裂 ,繼而引起肝內(nèi)細胞外基質(zhì) (ecm)過度沉積與增生。在肝纖維化時,、 型膠原大量積聚 ,廣泛分布于肝間質(zhì) ,病理特征為匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增多 ,形成細小的條索與菲薄的間隔 ,由匯管區(qū)向小葉內(nèi)延伸 ,但無假小葉與再生結(jié)節(jié)形成。此時肝內(nèi)膠原的含量較正常時增加 4倍7倍,其實此種改變在肝損傷的早期即已出現(xiàn)。一般認為,肝纖維化的形成過程主要取決于膠原的合成、沉積與降解和吸收的

5、動態(tài)平衡 ,當膠原合成與沉積大于降解與吸收時則肝內(nèi)膠原纖維增加,逐漸形成肝纖維化1。肝纖維化持續(xù)發(fā)展的中心環(huán)節(jié)在于肝細胞損傷時對周圍非實質(zhì)細胞的不斷刺激 ,導(dǎo)致 ecm的大量合成與沉積 ,從而引起肝組織結(jié)構(gòu)的破壞與改建 2。并且 ,免疫介質(zhì)對細胞間質(zhì)尤其是膠原蛋白的代謝有重要的調(diào)節(jié)作用 ,其中轉(zhuǎn)化生長因子、il-11、腫瘤壞死因子等的作用尤為重要 ,這些細胞因子既損傷肝細胞 ,又刺激成纖維細胞增殖及生成大量膠原 3。ha產(chǎn)生于肝星狀細胞,在內(nèi)皮細胞中降解,肝纖維化時產(chǎn)生增加。肝纖維化時，內(nèi)皮細胞受體減少，攝取降解ha減少,加之ha通過側(cè)枝分流進入體循環(huán),因而血中ha水平增高,血清水平是判定肝纖

6、維化活動最敏感的指標4。轉(zhuǎn)化生長因子（tgf-1）在肝纖維化中的作用可以概括為：刺激pg和fn合成與分泌；降低ecm蛋白酶的活化、膠原酶的活性和pg的降解；提高血小板衍化生長因子（pdgf）mrna和細胞粘附受體的表達；使成纖維細胞和血內(nèi)單核細胞發(fā)生趨化作用5。祖國醫(yī)學(xué)無“肝纖維化”一詞 ,據(jù)其臨床癥狀、體征及病理特征可歸屬于“脅痛”、“積聚”、“瘕”、“臌脹”等范疇。其病因病機多屬嗜酒好醴或情志抑郁者 ,素常飲食不潔或常懷憤郁之氣 ,正氣內(nèi)虛 ,外感“濕熱毒邪”、“疫毒”、“蠱毒”等 ,外邪侵襲肝臟留而不去 ,阻滯肝經(jīng) ,肝脾不和 ,氣血不暢 ,終致氣滯血瘀 ,脈絡(luò)失養(yǎng) ,釀成瘀積之證。對其

7、病機的認識,但大多數(shù)認為瘀血是肝纖維化的基本病機。中醫(yī)藥抗肝纖維化的機制主要包括：中藥抗纖維化機制有：保護肝細胞，清除肝纖維化的誘發(fā)因素，抗脂質(zhì)過氧化，減輕肝細胞損害及其脂肪變性，同時中藥有較強的活血化瘀功效。抑制hsc 的活化增殖，中藥復(fù)方能較好地抑制 hsc 的活化增殖及活化的 hsc 合成分泌膠原的能力，抑制傳代大鼠 hsc 的增殖及強刺激因子 pdgf-bb 誘導(dǎo)的 hsc 的增殖，并且抑制傳代 hsc 的膠原生成率及其、型膠原的表達，其中對型膠原表達的抑制最強。抑制轉(zhuǎn)化生長因子-(tgf-)的分泌及其活性，tgf-是促肝纖維化形成最重要的細胞因子，它不但間接地引起 hsc 的活化增殖

8、，而且誘導(dǎo) hsc 分泌過量的 ecm。中藥復(fù)方能減少肝組織 tgf-1 的分泌量及其、型受體的表達量，還可直接抑制 hsc 分泌 tgf-1。促進 ecm 的降解，生理情況下，ecm 處于動態(tài)的生成和降解的代謝平衡中。肝纖維化發(fā)生時，這種平衡被打破，細胞外基質(zhì)不僅在數(shù)量上大大增加，沉積于肝臟，而且發(fā)生組分的改變或重構(gòu)。金屬蛋白酶組織抑制物-1(timp-1)表達增加是肝纖維化過程中膠原降解減少的主要原因，中藥復(fù)方可降低肝纖維化大鼠模型的肝組織中 timp-1mrna 表達等6。 參考文獻：1.程明亮 ,楊長青 .肝纖維化的基礎(chǔ)研究與臨床 m.第 2版 .北京 :人民衛(wèi)生出版社 ,2 0 0

9、2 ；92. shinizu i. sho-saiko-to. japanness herbal medicine for protection against hepatic fibrosis and carcinoma j. jgastroenterol hepatol,2 0 0 0 ,15(suppl):d84- 903. flisiak r. cytokines in the pathogenesis of liver fibrosisj przegl lek,1999,56 (9):604-6074. 孔憲濤.肝纖維化診斷指標及其評估.中華肝臟病雜志,1998,6(4):2435.

10、程明亮 ,楊長青 .肝纖維化的基礎(chǔ)研究與臨床 m.第 2版 .北京 :人民衛(wèi)生出版社 ,2002 ；9：576車穎，徐婷婷，姜妙娜，等. 中藥肝復(fù)康抗大鼠肝纖維化的實驗研究.中國中藥雜志，2004，6： 3主要研究內(nèi)容： 1. 建立模型 給大鼠腹腔注射40ccl4橄欖油溶液，首劑量為5.0 mlkg體重，以后每周注射2次，每次劑量3.0mlkg體重，持續(xù)6周，每周測量大鼠重量，調(diào)整四氯化碳劑量。造模開始2周給予高脂、低蛋白質(zhì)復(fù)合飼料(豬油20十膽固醇0.5十玉米粉79.5)，2周后改用普通飼料，6周造模期間用10白酒作為唯一飲料。（張萬國; 胡晉紅. 桑黃預(yù)防大鼠肝纖維化作用的實驗研究. 藥學(xué)

11、服務(wù)與研究 2002.06.15; 2(2): 82-84）2. 觀察指標 實驗動物一般情況 :體重、毛發(fā)、活動、攝食等情況及病死率。 應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察he染色后切片，觀察肝纖維化的程度。 肝指數(shù)：肝臟重量/大鼠體重 觀察其肝臟纖維化樣變化情況 以放射免疫方法檢測大老鼠血清中透明質(zhì)酸（ha）的含量； 免疫組化法檢測肝組織中tgf1。 4主要研究方法（臨床或?qū)嶒炘O(shè)計）及主要技術(shù)路線： 1. 實驗對象 wistar大鼠（清潔級、雌雄各半、體重180200g）50只。2. 分組 采用隨機方式進行分組 a組7正常對照組（n10）， b組肝纖維化模型組(n=10),c組軟肝寧預(yù)防組 (n=10),d組

12、軟肝寧高劑量治療組(n=10)，e組軟肝寧低劑量治療組（n10）。3.方法 動物分組及模型制備雄性witar大鼠,體重180200g,隨機分為8組:正常對照組(簡稱正常組)、病理模型對照組(簡稱病模組)、軟肝寧預(yù)防組(簡稱軟預(yù)組)、軟肝寧高劑量治療組(簡稱軟高組)、軟肝靈低劑量治療組(簡稱軟低組),每組10只。除正常對照組外,其余各組均復(fù)制肝纖維化模型，給大鼠腹腔注射40%ccl4橄欖油溶液，首劑量按體重計算為0.5ml/l00g，以后每周2次，每次劑量為0.3m1100g，持續(xù)6周，每周測量大鼠重量，調(diào)整四氯化碳劑量。造模開始2周給予高脂低蛋白復(fù)合飼料(豬油20十膽固醇0.5十玉米粉79.5

13、)，2周后改用普通飼料。6周造模期間用10乙醇作為唯一飲料。同時為維持病因刺激，每周仍注射1次40ccl4橄欖油溶液，劑量為0.3m1100g，持續(xù)4周。整個實驗過程為10周。給藥方法預(yù)防組于造模同時給藥,1次/日,每天下午6時灌胃,連續(xù)10w;治療組于造模第7w給藥,方法同預(yù)防組,至第10w末結(jié)束。用藥劑量為:軟肝寧預(yù)防組和軟肝靈高劑量組2ml/100g,軟肝靈低劑量組1ml/100g。病模組和正常組給予自來水2ml/100g灌胃。4.標本留取與指標檢測末次給藥24小時后大鼠稱重后 ,眼眶取血 ,離心取血清備用。用日立全自動生化儀檢測肝功能。放免法檢測大鼠血清中ha含量處死大鼠 ,解剖 ,取

14、肝臟迅速用天平稱重 ,并計算肝指數(shù)；將稱重后的肝臟右葉固定于10%福爾馬林溶液中 ,作蘇木素 -伊紅染色及膠原纖維染色 ,顯微鏡下觀察其肝臟纖維化樣變化情況。取肝左葉用免疫組化方法檢測肝組織tgf1。5.數(shù)據(jù)處理 spss統(tǒng)計軟件12.0版本， t檢驗。 5研究進度及具體時間安排：.預(yù)期結(jié)果： 6目前工作進展情況（預(yù)實驗情況）：7完成課題的具體條件協(xié)助導(dǎo)師指導(dǎo)的人員配備（姓名、單位、職稱、專業(yè)等）主要儀器設(shè)備情況（產(chǎn)地、型號等）實驗動物情況（品種、品系、品種級別、實驗室級別等）藥物試劑等來源情況（名稱、產(chǎn)地、批號等）協(xié)作單位及協(xié)作內(nèi)容落實情況其他（經(jīng)費來源等）8課題設(shè)計評分（開題報告小組成員填

15、寫）：評分依據(jù)評分標準得分評審人簽字實用性對醫(yī)療、教學(xué)、科研有何指導(dǎo)意義或應(yīng)用價值重大8.1-10較好6.1-8.0一定4.1-6.0一些2.1-4.0無2.0以下科學(xué)性設(shè)計構(gòu)思嚴密，方法可靠8.1-10設(shè)計構(gòu)思較嚴密，方法可靠6.1-8.0設(shè)計構(gòu)思有不嚴密之處，方法基本可信4.1-6.0設(shè)計構(gòu)思不夠嚴密，方法無明顯錯誤2.1-4.0設(shè)計構(gòu)思不嚴密，方法有錯誤2.0以下先進性國外未見報導(dǎo)8.1-10國內(nèi)未見報導(dǎo)6.1-8.0仿造或重復(fù)他人工作，有一定改進4.1-6.0仿造或重復(fù)他人工作，基本上無改進，但對解決某一方面技術(shù)問題，有需要2.1-4.0仿造或重復(fù)他人工作，無改進，也無需要2.0以下可行性研究工作已有相當基礎(chǔ)，人員、設(shè)備、臨床或?qū)嶒灮貤l件具備8.