植物基因組DNA的提取及檢測(cè)門穎麗

1、學(xué)號(hào)： 學(xué)年論文（本科）學(xué) 院 生命科學(xué) 專 業(yè) 生物科學(xué) 年 級(jí) 2009級(jí) 姓 名 門穎麗 論文題目 植物基因組DNA的提取及檢測(cè) 指導(dǎo)教師 盧東升 職稱 教授 成 績(jī) 2011 年 5 月 19 日目 錄摘 要1關(guān)鍵詞1Abstract1Key words10 引言11實(shí)驗(yàn)材料與方法21.1 實(shí)驗(yàn)材料21.1.1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇21.1.2 實(shí)驗(yàn)材料的保存和預(yù)處理21.2 實(shí)驗(yàn)方法21.2.1 CTAB緩沖液法21.2.2 SDS緩沖液法32 結(jié)果分析32.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果32.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果42.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析43 實(shí)驗(yàn)討論53.1 酚類物質(zhì)53.2 多糖物質(zhì)5

2、參考文獻(xiàn)：6植物基因組DNA的提取及檢測(cè)學(xué)生姓名：門穎麗 學(xué)號(hào)：學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)：生物科學(xué) 指導(dǎo)教師：盧東升 職稱：教授摘 要: 基因組是指細(xì)胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因間區(qū)域。植物除了細(xì)胞核基因組外，還有細(xì)胞質(zhì)基因組，后者包括線粒體基因組和質(zhì)體基因組。特定物種的基因組，包含了該物種生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息。研究基因組DNA，要求提取的DNA要有較高的純度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文庫(kù)的構(gòu)建以及基因探測(cè)等后續(xù)研究。對(duì)近年來(lái)關(guān)于植物基因組DNA研究中的采樣、DNA提取方法以及純化技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合評(píng)述，旨在為植物基因組DNA的研究提供理

3、論與技術(shù)參考。從瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果可以看出，菜花組織中酚類、多糖等化合物直接會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中提取DNA的純度和質(zhì)量，因此從中提取DNA的關(guān)鍵是有效地除去這些雜質(zhì)。關(guān)鍵詞：植物基因組DNA；提取；檢測(cè)Abstract: Genome refers to all the DNA cells, including all of the gene and gene room area. Plants in addition to the nucleus, besides the genome, which includes the cytoplasm genome mitocho

4、ndrial genome and plasmids genome. Specific genomes, contains the species growth, development and reproduction and so on each physical activity almost all information. Research genomic DNA extracted DNA, demanding high purity and yield for PCR, RFLP analysis, gene library construction and gene detec

5、tion etc follow-up study. About plants in recent years in the study of genomic DNA sampling, DNA extraction method and purification technology research progress on a comprehensive review aimed at the plant genomic DNA research provides theory and technique reference. From agarose gel electrophoresis

6、 and uv spectrophotometer testing results can be seen, cauliflower organization phenols, polysaccharide directly affect chemical compounds such as extracting DNA experiment, so the purity and quality is the key to extract DNA from effectively remove these impurities. Key words: plant genomic DNA; ex

7、tracted; detection0 引言 基因組是指細(xì)胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因間區(qū)域。植物除了細(xì)胞核基因組外，還有細(xì)胞質(zhì)基因組，后者包括線粒體基因組和質(zhì)體基因組。特定物種的基因組，包含了該物種生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息。研究基因組DNA，要求提取的DNA要有較高的純度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文庫(kù)的構(gòu)建以及基因探測(cè)等后續(xù)研究。而在DNA的提取過程中,采樣時(shí)間、提取方法以及純化技術(shù)等因素都對(duì)提取DNA的純度和得率有很大影響,進(jìn)一步影響對(duì)DNA的分析等后續(xù)研究。對(duì)近年來(lái)關(guān)于植物基因組DNA研究中的采樣、DNA提取方法以及純化技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜

8、合評(píng)述，旨在為植物基因組DNA的研究提供理論與技術(shù)參考。掌握從高等真核生物細(xì)胞中制備基因組DNA的基本原理，熟悉從高等植物中提取基因組DNA的技術(shù)流程。1 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料的處理包括2個(gè)方面：一為實(shí)驗(yàn)材料的選擇；二為實(shí)驗(yàn)材料的保存和預(yù)處理?？傮w上講，在材料的選取上，應(yīng)盡量采用植物的幼嫩部位，但仍應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件如植物的生長(zhǎng)周期、實(shí)驗(yàn)室離材料生長(zhǎng)地的距離、植物本身的生化性質(zhì)來(lái)選用何種部位為材料。一般都取植物的嫩葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而一些衰老的葉片則可以先在4的黑暗中饑餓1d，以消耗掉淀粉和其它多糖類物質(zhì)。除葉片外，植物的另外一些部位有時(shí)也可以成為較好的試驗(yàn)材料1。1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

9、的選擇實(shí)驗(yàn)材料以菜花幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，采集新鮮葉片數(shù)片洗凈后再用去離子水清洗2次，晾干，置于4冰箱冷藏室內(nèi)備用。1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料的保存和預(yù)處理為了得到高質(zhì)量的基因組DNA，應(yīng)采用正確的保存方法使得樣品材料盡量不要受到機(jī)械損傷和不被氧化褐變，DNA不為內(nèi)源核酸酶催化降解等。常用的保存方法有低溫保存和脫水干燥保存2種2。1.2 實(shí)驗(yàn)方法提取基因組DNA時(shí)，細(xì)胞裂解是必經(jīng)的步驟，而能否得到高質(zhì)量的DNA，這一步非常重要。其中，裂解緩沖液的組成以及溫浴的時(shí)間和溫度都與結(jié)果有直接或間接的關(guān)系。細(xì)胞裂解緩沖液中一般含有表面活性劑，常用的有CTAB和SDS。緩沖液成分一般應(yīng)根據(jù)分離對(duì)象、后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)DN

10、A產(chǎn)品的質(zhì)量及數(shù)量的要求不同進(jìn)行選擇和調(diào)整，緩沖液的pH、保護(hù)劑和表面活性劑的種類及含量等都要事先進(jìn)行優(yōu)化3。1.2.1 CTAB緩沖液法取超低溫(-86)保存的健康無(wú)病斑菜花(約1g)，放置在冷凍的研缽中，在研磨時(shí)加入適量的抗壞血酸和聚乙烯吡咯烷酮，用冷凍的研杵快速研磨成干粉狀，裝入1.5mL的Eppendorf中1/3體積，迅速加入680L、65預(yù)熱的CTAB緩沖液和100L-巰基乙醇，上下顛倒數(shù)次，使材料與緩沖液充分混勻，然后置于65水浴中水浴1小時(shí)后，取出Eppendorf管稍冷卻，加氯仿-異戊醇(241)混合液至1.5mL，混合后于8000rpm離心10min，吸取上清，重復(fù)此步驟至

11、看不到界面上有白色沉淀環(huán)。加入2倍體積的冷乙醇或2/3體積的異丙醇，4靜置30min,12000rpm離心20s，棄上清液，加入500LDNA洗滌緩沖液，放置30min，倒去洗液，用70%乙醇洗滌2次，空氣中自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)(冷風(fēng))吹干，溶于80L0.1TE中，置于-20保存?zhèn)溆?。1.2.2 SDS緩沖液法實(shí)驗(yàn)步驟：取幼嫩無(wú)病斑菜花(約1g)置于冰凍的研缽中，加入適量固體抗壞血酸和聚乙烯吡咯啉酮，研成粉末，裝入1.5mL的Eppendorf中1/3體積，加入預(yù)熱至65的提取介質(zhì)680L和巰基乙醇100L，2%的抗壞血酸50L和2%的聚乙烯吡咯啉酮50L，65溫浴1.5h，用氯仿-異戊醇抽提

12、23次至界面上無(wú)白色沉淀環(huán)為止。取上清液，加入2/3體積的2.5mol/L pH4.8的KAC溶液，2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液及巰基乙醇各10L0放置30min后，低溫(410000rpm)離心10min，上清液中加入2倍體積的冷乙醇，4靜置30min后，412000rpm離心30s收集沉淀。經(jīng)洗滌緩沖液洗滌數(shù)次，再用70%乙醇洗滌2次，自然風(fēng)干，并溶于40L0.1TE溶液中，置于-20保存?zhèn)溆?。2 結(jié)果分析2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果將所得的DNA樣品于0.8瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，并判斷DNA濃度及相對(duì)分子質(zhì)量大小。高鹽溶液中除含有CTAB-核酸復(fù)合物

13、外，還含有大量的多糖和蛋白。用氯仿先對(duì)此高鹽溶液進(jìn)行抽提，大量蛋白和多糖等被從溶液中抽提沉淀出來(lái)，而核酸仍留在溶液中；接著可用乙醇或異丙醇將核酸從溶液中沉淀出來(lái)，然后用水或TE緩沖液等將核酸溶解。由CTAB法、SDS法分離提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，其電泳帶可見1條約15kb的DNA主帶，點(diǎn)樣孔內(nèi)無(wú)亮點(diǎn)，帶型清晰無(wú)拖尾，說明所提取的DNA保持完好。其中用CTAB法所提取的基因組DNA主帶最亮、最清晰，提取的質(zhì)量最好，DNA的質(zhì)量濃度最大；而用SDS法所提取的基因組DNA有降解現(xiàn)象6。1：CTAB法；2：SDS法；圖：改進(jìn)方法提取基因組DNA的比較2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果將所得的DN

14、A提取液于752型紫外分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)260,280nm處的吸光度:根據(jù)A260/A280的值判斷DNA純度，以A260計(jì)算DNA質(zhì)量濃度并得出DNA得率。我們采用CTAB法、SDS法提取菜花的基因組DNA，在有效除去細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)，抑制次生代謝物與DNA的結(jié)合，所得的DNA溶液呈無(wú)色透明狀。將這兩種方法所得的DNA吸取10uL用去離子水稀釋至3mL，在752型分光光度計(jì)上測(cè)定其A260，A280，判斷其純度得率。用CTAB法、SDS法提取的基因組的A260/A280的值在1.8-2.0之間，純度較高，符合分子生物學(xué)研究。其中CTAB法所提取的DNA純度最高，質(zhì)量濃度也最大。表：用不同方法提取

15、的基因組DNA測(cè)定結(jié)果基因組DNA提取法A260A280A260/A280DNA質(zhì)量濃度（ug.uL-1）CTAB法0.1930.0981.972.895SDS法0.11310.0701.871.9652.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析由瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果，我們可以清楚的看到在對(duì)菜花的基因組DNA提取的試驗(yàn)中，CTAB緩沖液法的效果明顯比SDS緩沖液法好。產(chǎn)生這種結(jié)果的主要原因可能是，CTAB緩沖液比較適用于草本植物和不含酚類或含酚類較少的植物DNA提取；SDS緩沖液在植物基因組DNA的提取中應(yīng)用較少，主要應(yīng)用于對(duì)模板DNA質(zhì)量要求不太嚴(yán)的RAPD分析。因此在提取菜花這種屬于十字花科的植

16、物來(lái)說，CTAB緩沖液對(duì)于提取其的DNA更加適合7。3 實(shí)驗(yàn)討論從瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果可以看出,菜花組織中酚類、多糖等化合物直接會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中提取DNA的純度和質(zhì)量,因此從中提取DNA的關(guān)鍵是有效地除去這些雜質(zhì)。3.1 酚類物質(zhì)酚類物質(zhì)是芳族環(huán)上的氫原子被羥基或功能衍生物取代后生成的化合物，廣泛分布于植物體,是植物體內(nèi)重要的次生物質(zhì)之一。酚類物質(zhì)經(jīng)氧化后易于DNA共價(jià)結(jié)合引起褐變以及在用氯仿抽提時(shí)的丟失。為有效除去酚類物質(zhì)，在研磨時(shí)加入抗壞血酸PVP，用PVP和抗壞血酸，是利用它的“-CO-N=”基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而

17、加強(qiáng)，結(jié)合成復(fù)合物后，通過離心除去。另外，在加入提取液時(shí)，加入B-巰基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚類物質(zhì)被氧化，主要是“-SH基”可以打斷多酚氧化物酶的二硫鍵而使之失活，防止酚類化合物被氧化。提供-SH防止褐變的化合物很多，如二硫蘇糖醇、B-巰基乙醇、半胱氨酸及抗壞血酸等。選用哪種、什么濃度最合適要針對(duì)植物材料通過實(shí)驗(yàn)確定。通過這些措施，可以防止酚類物質(zhì)被氧化而使DNA褐化，從而得到白色DNA沉淀8。3.2 多糖物質(zhì)多糖是影響植物DNA純度的另一常見因素，這類化合物可于DNA同時(shí)沉淀，使DNA提取物呈膠狀，從而影響對(duì)DNA樣品的濃縮，而且干擾后續(xù)操作，如抑制某些DNA修飾酶的活性，影響用分光

18、光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量分析等。CTAB有一獨(dú)到優(yōu)點(diǎn)就是能有效沉淀多糖，再通過氯仿、異戊醇抽提，也可除去一部分多糖，但通過上述方法還不能完全。除去多糖對(duì)脫皮榆DNA提取的影響。實(shí)驗(yàn)中將DNA粗提物用TE溶液充分溶解，離心 后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。除了DNA純度對(duì)后續(xù)操作影響較大外， DNA片段的長(zhǎng)度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響6。DNA對(duì)剪切力極為敏感，為了得到盡可能大的DNA片段，在提取過程中要注意以下的問題：應(yīng)盡量簡(jiǎn)化操作步驟，減少轉(zhuǎn)移DNA的次數(shù)，離心速度，離心時(shí)間等；提取過程中應(yīng)溫和操作，避免劇烈震蕩，用較粗的槍頭吸取上清液，吸取過程中避免產(chǎn)生氣泡，不要通過反復(fù)吸打的方法助溶DNA。為了得到質(zhì)量較高的總DNA，在提取時(shí)，要特別注意取材，盡可能選取較嫩的葉組織。由于個(gè)體的不同發(fā)育時(shí)期，組織細(xì)胞中的組成成分不同，以及隨著個(gè)體發(fā)育，植物組織細(xì)胞內(nèi)的組成成分更加復(fù)雜多樣，尤其是酚類化合物、多糖、萜類化合物以及一些次拿代謝物和一些未知化合物的含量增加，都會(huì)給總DNA提取帶來(lái)困難?？傊?，抗壞盂及B-SH等抗氧劑對(duì)木本植物基因組DNA的提取是必須的9。參考文獻(xiàn)：1鞏艷紅,劉軍.毛豹皮樟葉片DNA的提取J.四川：四川林業(yè)科技.200