濾膜法測定總大腸菌群

1、濾膜法測定總大腸菌群1 主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了生活飲用水中總大腸菌群的濾膜測定方法。 本方法適用于生活飲用水和低濁度的水源水中總大腸菌群數(shù)的測定。2 方法提要用孔徑為0.45 ym的微孔濾膜過濾水樣，細(xì)菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培 養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù)。3 培養(yǎng)基與試劑3.1 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基3.1.1 成份A 蛋白胨 10gB 酵母浸膏 5gC 牛肉膏 5gD 乳糖 10gE 瓊脂 1520gF 硫酸氫二鉀 3.5gG 無水亞硫酸鈉 5g 左右H 堿性品紅乙醇溶液 (50g/L) 20mLI 蒸餾水 1000mL3.1.2 儲存培養(yǎng)基的制備

2、先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另500mL蒸餾水中加入硫酸氫二鉀、蛋 白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，混勻后調(diào)pH為7.27.4，再加入乳糖，分裝，115 C高壓滅菌20min，儲存于冷暗處備用。3.1.3 平皿培養(yǎng)基的配制將上法制備的儲存培養(yǎng)基加熱融化， 用滅菌吸管按比例吸取一定量的 5堿性品紅乙 醇溶液置于滅菌空試管中， 再按比例稱取所需的無水硫酸鈉置于另一滅菌試管中， 加滅菌水 少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸 10min 以滅菌。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液， 滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉 色為止，將此亞硫酸鈉

3、與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲存培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻 ( 防止產(chǎn)生氣泡)，立即將此種培養(yǎng)基 15mL傾入已滅菌的空平皿中。 待冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此種以制成的培養(yǎng)基于冰箱內(nèi)保存不宜超過二周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變?yōu)樯罴t色， 則不能再用。3.2 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基3.2.1 成份A 蛋白胨 10gB 牛肉膏 3gC 乳糖 5gD 氯化鈉 5gE 溴甲酚紫乙醇溶液 (16g/L) 1mLF 蒸餾水 1000mL3.2.2 制法將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中， 調(diào)整 pH 為 7.27.4 ，再加入 1mL1.6溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，115C高壓滅菌2

4、0min，貯存于冷暗處備用。4 儀器4.1 濾器。4.2 濾膜，孔徑0.450.65卩m直經(jīng)根據(jù)濾器規(guī)格，目前常用的有3.5cm和4.7cm兩種。4.3 抽濾設(shè)備。4.4 無齒鑷子。4.5 培養(yǎng)箱：36 1C。4.6 冰箱:04 C。4.7 天平。4.8 顯微鏡。4.9 平皿 : 直徑為 9cm。4.10 滅菌刻度吸管 : 1mL,10mL。5 檢驗步驟5.1 準(zhǔn)備工作5.1.1 濾膜滅菌 :將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次 煮沸后需更換水洗滌 23 次，以除去殘留溶劑。5.1.2 濾器滅菌：用點燃的酒精棉球，火焰滅菌。也可用 121 C高壓滅菌2

5、0min。5.2 過濾水樣用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，帖放在已滅菌的濾床上、，固定好濾器，將100mL水浴(如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂?注入濾器中， 打開濾器閥門，在負(fù) 0.5 大氣壓下抽濾。5.3 培養(yǎng)水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基 (36.1.3.1) 上，濾膜截留細(xì)菌面向上， 濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全 貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2224h。6 觀察結(jié)果6.1 挑出符合下列特征菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。 紫紅色，具有金屬光澤的菌落。深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。 淡紅色，中心色較深的菌落。6.1.1凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)基液，于37C培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽性。6.1.2