五種電泳技術(shù)的比較

1、五種電泳技術(shù)的比較 SDSPAGE 名詞解釋： 相對遷移率(R) 問答題： 1. 簡述SDS-PAGE的基本原理。 2. 影響SDS電泳的關(guān)鍵因素有哪些 AGE 名詞解釋 1. 遷移率 2. 電滲 3. 電泳 問答題 1. 影響電泳遷移率的因素有哪些 2. 試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。 CAME 的基本原理是什么 分離血清蛋白電泳時應(yīng)注意哪些問題 PAGE 名詞解釋 1. 凝膠總濃度 2. 交聯(lián)度 問答題 1. 與CAME相比，PAGE有哪些特點。 2. 試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。 3. 簡述不連續(xù)PAGE的原理。 1瓊脂糖凝膠電泳 Agarose Gel Electroph

2、oresis Gel Electrophoresis :由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì) 作支持體的電泳。 特點(characteristic)： 1可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點在凝膠的孔中泳動。 2. 電泳操作方法簡便，電泳速度快。 3. 分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。 4. 適用于生化，免疫等定性定量測定。 ()優(yōu)點(advantage) 1. 因不含硫酸根和敖基，幾乎消除了瓊脂的電滲。 2. 對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。 3. 凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。 4透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。 5. 不吸收紫外光，可直

3、接利用紫外光吸收法作定量測定。 6. 有熱可逆性。 (二)缺點(disadvantage) 1機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。 2. 易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。 3. 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。 4與PAGE相比，分子篩(molecular sieve)作用小，區(qū)帶少。 應(yīng)用 1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化 2. 臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測 3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo) 影響遷移的因素 the size of the molecule conformation of the mole

4、cule the agarose concentration of a gel Voltage 百分濃度和分辨率限制 Most agarose gels are made with between % (good separation or resolution of large 5 - lOkb DNA fragments) and 2% (good resolution for small -lkb fragments) agarose dissolved in e1cctrophoresis buffer Up to 3% can be used for separating very

5、tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺 is more appropriate in this case Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels arc common for many applications 瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白 原理：血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂

6、糖礙膠為支持介質(zhì)，在巴比 妥緩沖液中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。 pH pl ,各種脂蛋白均帶負(fù)電，電泳時由負(fù)極到正極；VLDL為圓形， 受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加樣槽在負(fù)極，由負(fù)極到正極分別是CMLDLVLDLHDL 2醋酸纖維薄膜電泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis CAME 特點：低吸附作用，低電滲作用，樣本用量少，親水性 sorption electroosmosis sample 電泳圖譜不齊 點樣時血清點加不均勻 薄膜局部干燥 電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 緩沖液變

7、質(zhì) 電泳時薄膜位置不正，與電流方向不平行 電泳圖譜分理不淸 點樣時血淸點加不均勻 薄膜局部干燥 電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 緩沖液變質(zhì) 電泳時薄膜位置不正，與電流方向不平行 電泳速度慢 電流過低 供給薄膜的液量不足 緩沖液離子強(qiáng)度過高 薄膜中雜質(zhì) 白蛋白區(qū)帶中間部分不著色，染色不足 染色時間不夠、點樣過多 Y球蛋白向反方向移動 電滲現(xiàn)象，可提髙緩沖液液而或加大電流量以改進(jìn) 區(qū)帶一邊長一邊短呈扭曲現(xiàn)象 薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上，使薄膜接觸不良而增大了電阻。 區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過于緊密 緩沖液離子強(qiáng)度V可出現(xiàn)區(qū)帶拖尾；離子強(qiáng)度可出現(xiàn)區(qū)帶過于緊密。 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳Separate

8、serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 原理CAME是以醋纖膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。 將血清樣品點樣于醋纖膜上，在的緩沖液中電泳時，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向 正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各 異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。加樣：用加樣器蘸取血清約5ul,垂直印在CAM 粗糙面，點樣區(qū)距離邊緣約，電泳時點樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓 1015V/cm膜總寬。電泳4060分鐘，泳動距離約達(dá)4cm時即可斷電。 由負(fù)極到正極可分為五條條帶

9、Y B 2 a 1白蛋白 3. 聚丙烯酰胺凝膠電泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE PAG是由丙烯酰胺(acrylamide, Acr)單體和N, N，-亞甲雙丙烯酰胺(N, N, N , N -methylene bisacrylamide, Bis)交聯(lián)劑通過自由基(free radicals)聚 合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 過硫酸胺(NH)aSaO.J (Ammonium persulfate, AP)作為催化劑，四甲基乙二胺 (-N, N, N, N -tetramethylethylene diamine , T WAI ；D)為加

10、速劑。 TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 研高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合 PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的 大小，選擇合適的單體濃度。 Acr/Bis： 2040 100 完全透明且有彈性； 很脆，易碎，不透明; 糊狀不成形，易破碎 常用的標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為%的凝膠 交聯(lián)度C一一Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。 C=b/ (a+b) X100% 電極槽緩沖液通常為Tris-甘氨酸緩沖液 分離原理 1. 濃縮效應(yīng) 1) 凝膠層的不連續(xù)性 兩層凝膠T與C不同孔徑不同 濃縮膠

11、孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動，受阻力小，移動速度 快。 2) 緩沖液離子成分的不連續(xù)性 甘氨酸(pl=)在帶負(fù)電，朝正極移動，進(jìn)入濃縮膠()，甘氨酸解離度()很小， 有效遷移率(M )很低，移動速度較慢，稱為慢離子。 HC1是強(qiáng)電解質(zhì)，=1, CT有效遷移率大，移動速度快，稱快離子。 蛋白質(zhì)(pl Tween Triton 陽離子去污劑；cetyltrimethyl aomonium bromide (CTAB) cetylpyyridinium (CPC) 陰離子去污劑：SDS deoxycholate 電泳過程中的不正?，F(xiàn)象 (1)“微笑”現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的

12、曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。 2) “皺眉”現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底 部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。 (3) “拖尾”現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起。 (4) “紋理”現(xiàn)象 由于樣品中的不溶顆粒引起的。 (5) 偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起 (6) 帶太寬 加樣量太多或加樣孔泄漏引起 分子量測定 1、相對遷移率(relative mobility , Rf) Rf即用每個帶的遷移距離除以漠酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。 測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離 Rf= 漠酚藍(lán)遷移距離 蛋白帶遷移距離固定前

13、的凝膠長度 Rf= X 干燥后的凝膠長度漠酚藍(lán)遷移距離 2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖 3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量 5.等電聚焦電泳 Isoelectric Focusing Electrophoresis, IEFE 等電聚焦電泳(IEFE)是一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點電(PI)不同的蛋白質(zhì) 的電泳技術(shù)。 原理：在電泳介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通電后，兩性電解質(zhì)會逐漸形成一個由 正極到負(fù)極遞增的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動并聚焦于與其等電點相當(dāng)?shù)膒H 位置。 理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定； 分子量要小 以便與被分離大分子物質(zhì)分離； 各成分的Pl彼此接近，并在其pl值附近有良好的緩沖能力 梯度穩(wěn)定； 兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多 梯度平滑； 對280nm的紫外光沒有或僅有很低