凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法

1、細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、 生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多， 下面介紹幾種常用的 測(cè)定方法。一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋 亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核 膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以

2、細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的 DNA 特異性染料有：H0 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258）, DAPI。 三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成 1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為 0.5 1mg/ml。結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分

3、為三期：I期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled ）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；n a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高 度凝聚、邊緣化；n b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體 （圖1）。3透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡1期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)（圖2）；n a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（ Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正

4、常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期， PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中（圖3）。Ann ex in-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Ann ex in-V 進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biot in標(biāo)記，以標(biāo)記了的 Ann ex in-V作為熒光探針，利用流式 細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中 晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將 Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋

5、亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。方法1懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.51 X106）用PBS洗2次，加入 100ul Bi ndi ng Buffer 和 FITC 標(biāo)記的 Ann ex in-V （20ug/ml） 10ul，室溫避光 30min，再 加入 PI （50ug/ml） 5ul，避光反應(yīng) 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 進(jìn) 行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過1h）,同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。2貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。3爬

6、片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果圖4、圖5注意事項(xiàng)1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。2. 操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。三、線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位 DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的 事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocya

7、nine iodideDiOC6 （ 3）卜 Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的 增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123 （ 1mM）或終濃度為 DiOC6 （ 25nM ）, JC-1（ 1mM），TMRM （ 100nM）, 37 C 平衡 30min，流式 細(xì)胞計(jì)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。注意事項(xiàng)1. 始終保持平衡染液

8、中pH值的一致性，因?yàn)?pH值的變化將影響膜電位。2. 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的 濃度，引起假去極化。四、DNA片斷化檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段，或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠 電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純 DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純 DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶

9、（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色體DNA片段的測(cè)定細(xì)胞凋亡的早期，染色體斷裂成為50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的 雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA , DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為”爬行。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交

10、的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移 動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開。參考文獻(xiàn) Brow n,D.G., Sun, X.M., and Cohe n, G.M.（1993） Dexamethaso ne-i nduced apoptosis in volves cleavage of DNA to large fragme nts prior to internu cleosomal fragme ntatio n. J. Bi

11、ol.Chem. 268, 3037-30392. DNA Ladder 測(cè)定方法：收獲細(xì)胞（T 10）沉淀？細(xì)胞裂解液？13000rpm 5min,收集上清？1%SDS和RnaseA(5mg/ml) 56 C,2h?蛋白酶K( 2.5mg/ml )37 C,2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀 DNA , 4 C 過夜？14000rpm 15miS后將沉淀溶解在 TE buffer 中，力口 DNA Loading Buffer?1.2% 瓊 脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。結(jié)果：圖6參考文獻(xiàn) Herrma nnm M, Lore nz HM, Voll R et al.

12、 A Rapid and simple method for theisolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-55073. 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析方法：收集細(xì)胞？70%冷乙醇(in PBS) 4C固定過夜？PBS洗滌，1000rpm 10min?RNase A (0.5mg/ml) 37 C 消化 30min?PI (50mg/ml)染色，室溫避光 15min?FACScan 分析 DNA 亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。結(jié)果：圖74. ApoAlertTM LM-PCR Ladder

13、 Assay (CLONTECH)優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測(cè)。五TUNEL法細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT )的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿 性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(termi nal -deoxy nu cleotidyltransferase mediated nick end labeling, TUNEL )。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾

14、乎沒有DNA的斷裂，因而沒有 3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。六、Caspase-3活性的檢測(cè)Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD )的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段

15、，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD )和兩個(gè)小亞基(12KD )組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的 晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。1 Western blot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚(ADP-核糖)聚合酶poly (ADP-ribose ) polymerase, PARP等的裂解。方法：收集細(xì)胞tPBS洗滌t抽提細(xì)胞裂解液t蛋白定量tSDS-PAGE電泳t硝酸纖維素膜 或PVDF膜轉(zhuǎn)移t5%脫脂奶粉封閉，室溫1.52h或4C過夜tCaspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng) 1

16、2h 或 4C 過夜 tTBS -T (含 0.05% Tween 20 的 TBS )洗 3 次，510min/次tHRP- 標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)12hT TBS -T洗3次，510min/ 次?tECL顯影或NBT/BCIP 顯色。結(jié)果：圖8-1、圖8-22熒光分光光度計(jì)分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割 D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一 特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出 AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定

17、caspase-3的活性，從而反映 Caspase-3被活化的程度。方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞？PBS洗滌？制備細(xì)胞裂解液？加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）？37C反應(yīng)1h?熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激 發(fā)光波長(zhǎng)380nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為 430-460nm）。結(jié)果：圖93流式細(xì)胞術(shù)分析方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞？PBS洗滌？加Ac-DEVD-AMC?37 C反應(yīng)1h?UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果：圖10七、凋亡相關(guān)蛋白 TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析TFAR19（ PDCD5）是由本研究室在國際上

18、首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新 基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。 利用熒光素（FITC ）標(biāo)記的TFAR19 單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長(zhǎng) 時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核 DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早 期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn) TFAR19高表達(dá)和核

19、轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提 供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。（一） TFAR19蛋白的細(xì)胞定位分析材料試劑：FITC 標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4、0.15Mol/L PBS ,3%的多聚甲醛，PBS-T（ pH7.4、0.15Mol/L PBS含0.2% Tween 20 ），胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液： pH7.4、0.15Mol/L PBS 含2%胎牛血 清及0.1%NaN3。FACS管，Tip頭，移液器。儀器：低溫水平離心機(jī)，37 C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞 計(jì)方法：1懸浮細(xì)胞的染色：（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.51 106 , PBS洗2次，10

20、00rpm 10min（2）3%多聚甲醛冰浴 10min , PBS 洗 2 次，1000rpm 10min（3） 加入 PBS-T 溶液，37C 孵育 15min , PBS 洗 2 次，1000rpm 10min（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng) 30min。（5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為 1 : 40）, 4C反應(yīng)30min（6）熒光細(xì)胞洗液洗 2次，1000rpm 10min結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。圖112:貼壁細(xì)胞的原位染色（1） 貼

21、壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生 長(zhǎng)，待長(zhǎng)到50%80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。（2）將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。（3）將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（ 5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共 聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。結(jié)果觀察：圖123:臨床病理切片的染色、檢測(cè)。4:原代細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測(cè)。5:分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位（二） TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病1. ELISA法檢測(cè)正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時(shí)期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。材料和

22、試劑：1. 包被 Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L 碳酸鹽 Buffer2. 洗滌液：pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含 0.05% Tween 203. 封閉液：3%BSA （用洗滌液配制）4. 酶標(biāo)抗體的稀釋：用封閉液稀釋5. OPD 底物 Buffer : Na2HPO4.12H2O 1.84g 檸檬酸0.51gDDW 100ml6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物 Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml7. 終止液 2Mol/L H2SO48.重組人 TFAR19, HRP 標(biāo)記的羊抗人 IgG9. ELISA 板,Tip, 移液器，ELISA

23、Reader （OD490nm ），洗板機(jī)操作步驟1. 用包被 Buffer 稀釋的重組人 TFAR19 （1mg/ml）包被 ELISA 板,100ml/well, 37 C孵 育2h或4C過夜（一般24h以上）。2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液， 200 ml/well , 37C孵育2h或4C 過夜。3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個(gè)重復(fù)孔）100ml/well , 37C孵育1h。設(shè)包被Buffer、洗滌Buffer、封閉液為陰性對(duì)照。4. 洗滌Buffer洗板三次，加入 1： 2500稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgG, 100ml/well , 37C 孵育1h。5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液， 100 ml/well，避光反應(yīng)1015min。6. 加入H2SO4終止反應(yīng)，50 ml/well。7. ELISA Reader讀取OD490光密度值，分析和比較病人血清和正常血清中TFAR19自身抗體的表達(dá)水平。2. Western blot分析原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的TFAR19蛋白的表達(dá)水平。幸福，