ELISA標準操作及技術服務的常見問題

1、ELISA 標準操作及技術服務的常見問題一.ELISA標準操作要點優(yōu)質的試劑， 良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水， 包括用于洗滌的， 應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化 水電導率小于 1.5(1 s/cm。1. 標本的采取和保存大部分 ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細 胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以 HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血標 本可能會增加非特異性顯色。 血清標本宜在新鮮時檢測。 如有細菌污染， 菌體中可能含有內 源性HRP，也會產生假陽

2、性反應。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4C,標本在冰箱中保存時間過長導致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的 需-20C保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。 混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。 反復凍融會使抗體效價跌落， 所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。 保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑?？鼓煌耆臉吮疽蚶w維蛋白原的干擾而造成假陽性， 建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝 劑。2. 加樣加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

3、3. 保溫在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37C經1-2 小時，產物的生成可達頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆 蓋板孔， 反應板不宜疊放， 以保證各板的溫度都能迅速平衡。 應注意溫育的溫度和時間應按 規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。 另外溫育中還有邊緣效應， 邊上的值會偏高， 建議為了客觀的判斷結果， 將質控放在非邊緣4. 洗滌洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟， 但卻決定著實驗的成敗。 ELSIA 就是靠洗滌來 達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。 通過洗滌以清除殘留在

4、板孔中沒能與固相抗原或 抗體結合的物質， 以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的， 而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在 ELISA 操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴 格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。 聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的， 非 離子型洗滌劑既含疏水基團， 也含親水基團， 其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合， 從而削弱蛋白質與固相載體的結合， 并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非

5、離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈 敏度。洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。 如果洗液需要稀釋， 應按要求稀釋， 所用的水電導 率最好在 1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。5. 顯色和比色TMB 經 HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至 2 小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS ）等酶抑制劑均可使反應終止。

6、這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（ 12-24 小時）不褪， 是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長 （450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀 ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性 能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標 儀的讀數一般可精確到 0.001，準確性為 1%，重復性達 0.5%。酶標儀不應安置在陽光或 強光照射下，操作時室溫宜在1530C，使用前先預熱儀器 15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀 A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。

7、有的酶標儀可用雙波長 式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（ W1 ），第二次在不敏感波長（ W2 ），兩 次測定間不 移動 ELISA 板的位置，最終測得的 A 值為兩者之差（ W1-W2） 。雙波長式測 讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。二.本底及假陽性產生的原因分析1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別1.1 基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：a分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b穩(wěn)定性好。

8、包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的 試劑盒效期只有 3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定簇，可提 高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g難度較大。1.2 合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽 片段。合成肽抗原有以下特點：a. 分子量太小b. 般只含有一個抗原決定簇c. 純度高d. 穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，ELISA 診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產品為合成肽抗原，主要是 HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽， 只是當時的基因工程抗原不全， 僅包括了 HCV 的核心區(qū)片段； 第三代產品基本上采用了基 因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的 HCV 特異性抗原。第三代試劑 的敏感度大大提高了。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量 ELISA 反應試劑盒，因此有些廠家為 了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠， 穩(wěn)定性也成問題。 值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流