實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

1、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線一、總rna 提取（sv total rna isolation system kit，promega）1. 低于30mg的樣品中加入175l 裂解緩沖液(sv rna lysis bufferbme)，充分勻漿。2. 加入350l 藍(lán)色的rna 稀釋緩沖液（sv rna dilution buffer），顛倒3-4次使樣品充分混合。3. 放入70水浴中裂解3min。注：溫育時間不要超過3分鐘，否則可能破壞rna的完整性。4. 14，000g 離心10 min。小心用移液器將上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf 管中。注：若是組織中脂肪含量較高，需重復(fù)幾次此步驟；避免吸到顆粒物。5.

2、 加入95%的乙醇200l于上清液，用槍頭沖吸3-4 次。6. 將其全部轉(zhuǎn)移到帶有濾膜的微型柱中，14,000g, 離心1min，棄濾液。7. 加入600l沖洗緩沖液（sv rna wash solution）, 14,000g, 離心1 min，棄濾液。注：確保sv rna wash solution已用乙醇稀釋過。8. 按樣品數(shù)量準(zhǔn)備dna 酶混合液，用于降解dna。每樣需40l黃色緩沖液, 5l 0.09m的mncl2和5l dna 酶配制的dna 酶混合液。注：dna 酶必須在冰上解凍；溫柔用移液器混合，不可渦旋。9. 確保加50l dna 酶混合液到濾膜中間，室溫保持15 min。1

3、0.加入200l 終止反應(yīng)緩沖液（sv dnase stop solution），14,000g, 離心1 min，不必棄濾液。注：確保sv dnase stop solution中已加入乙醇。11.加入600l 沖洗緩沖液（sv rna wash solution），14,000g，離心1 分鐘，棄濾液。12.再加入250l 沖洗緩沖液洗一次（sv rna wash solution），14,000g，離心2 min，棄濾液，轉(zhuǎn)移微型柱到新的洗脫管中。13.用100l 無rna酶的水（nucleasefree water）洗膜，14,000g，離心1min，-70保存洗脫下來的總rna。注：

4、確保無rna酶的水覆蓋膜表面。二、分光光度計檢查rna的濃度1、將上述中提取的rna液于65溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有rna溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。2、測定每一管的od260，當(dāng)洗出液中od為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 3、測定od260，合并含有rna的洗脫組分。4、按下面的公式計算總rna的濃度：總rna濃度（ug/ml）=od260*稀釋倍數(shù)*40 ug/ml。三、瓊脂糖凝膠電泳鑒定rna的完整性rna的檢測可以通過常規(guī)的瓊脂糖凝膠電

5、泳進(jìn)行完整性和質(zhì)量鑒定。一般在1%左右的凝膠就可以，上樣700-100ng的rna（一般1-3ul）,5v/cm電泳15-20分鐘即可。一般rrna占總rna的80-85%，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到28s(23s)和18s(16s)rrna。四、反轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)備：器具：超凈工作臺，水浴鍋，冰盒，移液器（10ul -pz2qjy ），槍頭（小白， 提rna用），ep管（500 ul，提rna用）。試劑：oligo（dt），total rna，depc h2o ，5buffer ，dntp（10mm/each），rnasin ，m-mlv。 反轉(zhuǎn)錄步驟：rq-,mq 1.oligo（dt） (50

6、0g/ml) 2ul w.(?o; ，total rna 5ul kte x (2g) 2.70水浴5min $t6+6 ,立即冰浴3min $t6+6 )cnh5z ,稍離心收集于管底。*lei 3.加入反轉(zhuǎn)錄體系 cdns; depc h2o 5ul _nh-r%b) ，5buffer 5ul m7u awm ，dntp（10mm/each）1ul k3t374t1b ， rnasin 1ul k3t374t1b ， m-mlv 1ul -pz2qjy 4.稍離心，42 1h amgyv6(-6 5.95 5min ， -20 貯存。五、pcr引物設(shè)計1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定需要擴(kuò)增的dn

7、a序列，并知道其cds區(qū)序列（編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū),即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)） ncbi網(wǎng)站查詢2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)。所選擇的酶切位點(diǎn)盡量為多克隆位點(diǎn)的中間酶切位點(diǎn)，且載體上其它地方無該酶切位點(diǎn)。這樣連接以后再構(gòu)建新的質(zhì)粒時選擇酶的空間更大些。并保證所需擴(kuò)增的dna序列中無該酶切位點(diǎn)（generuner分析）。3.初步確定設(shè)計的引物長度。一般為1530bp，引物過短會影響到擴(kuò)增的特異性，過長會影響擴(kuò)增速率。如果擴(kuò)增產(chǎn)物500bp，引物長度為1618bp即可。若擴(kuò)增產(chǎn)物為45kb，引物最好不要少于24bp。引物3末端應(yīng)含有所研究基因特異序列中的1730bp。4.正向引物的設(shè)計：

8、 酶切位點(diǎn)的位置選擇。一般情況下都需要在引物的5，3端增加酶切位點(diǎn)，然后利用該酶將擴(kuò)增產(chǎn)物切下，接到相應(yīng)的載體上。5.反向引物的設(shè)計（1）表達(dá)時，要考慮終止密碼子的位置，所擴(kuò)增的片段里必須包括終止密碼子 ，所以酶切位點(diǎn)應(yīng)該在終止密碼子后尋找。酶切位點(diǎn)的選擇原理與5端一樣。（2）擴(kuò)增的dna用于阻斷。與表達(dá)時相同，只是無需過于要求酶切位點(diǎn)的位置。6.應(yīng)注意堿基分布的均衡性。引物應(yīng)避免嘌呤或嘧啶的堆積現(xiàn)象，避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的同一堿基。7.檢查兩條引物是否存在二級結(jié)構(gòu)或二聚體8.計算tm值。一般退火溫度為5560，而tm值比退火溫度高515。兩條引物的tm值最好相同，相差不要超過3。9.特異性分

9、析。必須保證酶切位點(diǎn)后的特異性序列在已知的序列中不存在，否則會出現(xiàn)非特異性條帶。（generuner分析）六、pcr及電泳（一）pcr試劑：ddh2o 、buffer、dntp、mgcl2 模版：up、dp、taq 儀器及器具：移液器：2.5l , 10l, 100l ，槍頭：小白，黃，pcr小管、大小管架、小小管架、冰盒、記號筆、鑷子、廢液缸、離心機(jī)。步驟：小小管架放在冰盒中。用鑷子從小管盒中挑出小管，小管插在架上。大試管架上依次放上ddh2o，buffer，dntp，mgcl2，模版，up，dp，taq 。等待溶解。引物用299ml ddh2o溶解。依次加入：ddh2o 31.5lbuff

10、er 5ldntp 4lmgcl2 4l模版dna 3lup （20m） 1ldp （20m） 1ltaq 0.5l先打開試劑管蓋，再上槍頭，可有效保證槍頭少受污染避免下意識的使槍頭朝上動作的發(fā)生。用過的槍，槍頭朝桌里放置。以小體積向大體積中加入的原則加入試劑。邊打入液體邊把槍向后退，保證槍頭伸入液面下一點(diǎn)點(diǎn)即可，以免拿出槍頭的時候帶出過多溶液。加過的試劑向后退一排擺放。每加入一種試劑都盡量充分混勻，必要是可以更換大些的槍頭，反復(fù)吹吸。用完后把槍調(diào)回最大量程。放入pcr儀中，編輯程序。開始。（二）瓊脂糖凝膠電泳試劑：瓊脂糖、tae 樣品：goldeniew、marker儀器及器具：稱量紙、錐形

11、瓶、量筒、20l槍、小白槍頭、ep手套，棉手套、電泳槽及梳子、凝膠呈像系統(tǒng)、優(yōu)盤步驟：1. 取稱量紙，斜對折。留折痕。放在稱上，開稱，自動調(diào)零。用小勺取事先計算好量的瓊脂糖，倒入干凈的錐形瓶中，盡量不要讓粉末沾在內(nèi)壁上。用量筒量取25 ml tae ，倒入錐形瓶。2. 用20l槍，上小白槍頭，吸1.25l（0.05%）的goldeniew，插入液面，反復(fù)吸吹，退槍頭，調(diào)回最大量程。3. 把錐形瓶放入微波爐，中低火，加熱3min后觀察繼續(xù)加熱，直至看不到顆粒為止。戴ep手套，取8孔電泳槽及梳子，沖洗擦干。退掉ep手套。4. 戴ep手套，右手棉手套。取出錐形瓶，把溶液倒入電泳槽。插入梳子。等待30

12、min冷卻，計時。盡快清洗錐形瓶。5. 凝固后，戴ep手套，先兩端起開一點(diǎn)梳子，再將梳子完全拔出。拿出膠放如電泳緩沖液中。上樣孔在負(fù)極一端。退掉ep手套。6. 在干凈的ep手套上用20l槍點(diǎn)若干6buffer，各1l，按順序吸出樣品各5l，用槍吹吸與buffer混合。7. 上樣，槍應(yīng)盡量垂直。當(dāng)看不清加樣孔時，先打下一點(diǎn)樣品，待有色樣品沉淀后即可顯示出明顯的上樣孔輪廓。8. 接通電源，+ -極，電壓85伏特，恒壓。（一般6的會有兩條帶，而10的只有一條帶。）9. 電泳到適當(dāng)位置后，拔下陰極，關(guān)掉電泳儀。戴ep手套，拎出膠版，推出膠。放在左手手心。10. 524，右手裸手打開凝膠呈像系統(tǒng)開關(guān)。右

13、手抽出抽屜，左手把膠放在中間位置。反退手套。推上抽屜。11. 打開qo，file/doc，開紫外，調(diào)節(jié)到圖片最佳效果，save保存，關(guān)紫外。file/export jepg圖畫可編輯。12. 裸手拉開抽屜，戴ep手套，取出膠，丟棄，用吸水紙擦干抽屜。推進(jìn)。13. 關(guān)電源。七、瓊脂糖凝膠電泳回收1.在紫外燈下切下含有目的dna 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。1. 計算凝膠重量（提前記錄1.5 ml 離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如100 mg = 100 l 體積）。2. 根據(jù)凝膠濃度加入成比例的buffer de-a。 * agarose% buffer de-a1.0%

14、 3個凝膠體積1.5% 4個凝膠體積2.0% 5個凝體積膠3. 混合均勻后于75c 加熱，每2-3 min混合一次，直至凝膠塊完全熔化（約 6-8 min）。5.加0.5 個buffer de-a 體積的buffer de-b，混合均勻。注意：當(dāng)分離的dna 片段小于500bp 時，加入1個凝膠體積的異丙醇，終濃度為20%。6制備管置于2 ml 離心管。吸取步驟5中的混合液，轉(zhuǎn)移到制備管中，12,000g 離心1 min。若混合液過多可分多次過柱。7棄濾液，將制備管置回原2 ml 離心管離心管，加500l buffer w1，12,000g 離心1min。8. 棄濾液，將制備管置回原2 ml離

15、心管，加0.7 ml buffer w2，* 確認(rèn)在buffer w2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。12,000g 離心1min。（可選：同法再用0.7 ml buffer w2 洗滌一次12,000g 離心1 min）9. 棄濾液，將制備管置于原2 ml 離心管中，12,000g 空離心1 min。10. 將制備管置于潔凈的1.5 ml 離心管中，在dna 制備膜正中央加25-30 l 水或eluent，室溫靜置1 min。12,000g 離心1 min 洗脫dna。11. 回收后的dna如不馬上用就儲存于-20，在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。八、t-easy的連接和

16、轉(zhuǎn)化單克隆篩選操作過程(一)、 連接反應(yīng)(10ul體系)， 2xbuffer 5dna 4t-easy 0.5ligase 0.5 4，過夜。(二)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化1、從-70冰箱中取100l感受態(tài)細(xì)胞dh5懸液, 冰上解凍。2、加入連接反應(yīng)液,輕輕搖勻,冰上30min。 3、42水浴中熱擊90-105秒,迅速置于冰上3-5min。4、加入1ml lb液體培養(yǎng)基(amp-), 37 150rpm 1.5 h,5、將菌液在1200g離心10min，棄上清液流150-250l，再用移液器反復(fù)吹吸混勻沉淀。將菌液涂布于平板上(x-gar 40ul，iptg 4ul),正放1.5h后倒置培養(yǎng)皿,37,

17、16-24h。(三)、單克隆挑選1、1000l移液槍，藍(lán)槍頭，酒精燈，火柴，pe手套，滅菌的玻璃管，液體lb含amp+，超凈臺中紫外20min，風(fēng)機(jī)10min。2、lb液體培養(yǎng)基分裝于刻度管中，各5ml。培養(yǎng)基體積不要超過容積體積的1/4.3、用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含0.1% amp的lb液體培養(yǎng)基中,37,250rpm16h。九、小量質(zhì)粒dna提取操作過程1.5ml-5ml的菌液離心13000g, 1min輕輕倒掉或吸掉培養(yǎng)基，加250ulsolution/rnase a。渦旋或反復(fù)吸吹以充分懸浮細(xì)胞.加250ulsolution,溫柔顛倒旋轉(zhuǎn)ep管使溶菌產(chǎn)物澄清，室溫孵育2-4 m

18、in.（不用時擰緊）加350ulsolution并立即顛倒充分混勻直到見白色絨毛狀的沉淀.離心13000g, 10min可見緊質(zhì)白色沉淀,立即小心的將上清加入吸附柱上.不要擾動沉淀,不要吸到細(xì)胞殘片.離心13000g, 1min棄濾液，加500ul buffer hb 于吸附柱上, 去除殘留蛋白.離心13000g, 1min棄濾液，加700ul加乙醇的wash buffer 洗柱1min .若乙醇被冰凍則要事先拿到室溫.離心13000g, 1min重復(fù)上步驟一次(可選)棄濾液，必須空離.13000g, 1min將柱子放入1.5mlep管加入40ul超純水,室溫1-2min.離心13000g, 1min -20保存十、wizard sv 凝膠及pcr 純化系統(tǒng)1 切膠前后稱重，得到膠重。2 加入膜結(jié)合液（10mg膠：10 ul溶液），輕柔混勻，50-65孵育10min，每隔數(shù)分鐘混勻一次，至膠塊完全融解，稍離心。3 融膠轉(zhuǎn)移到sv mi