烷化劑對(duì)野生型和缺陷型Ames試驗(yàn)菌株DNA修復(fù)的劑量效應(yīng)的定量評(píng)價(jià)(20210517223428)

1、烷化劑對(duì)野生型和缺陷型Ames試驗(yàn)菌株DNA修復(fù)的劑量效應(yīng)的定 量評(píng)估容細(xì)胞暴露在DNA破壞因子前，可能會(huì)通過(guò)堿基直接錯(cuò)配或間接 修 復(fù)過(guò)程，導(dǎo)致基因突變和染色體斷裂，引發(fā)潛在DNA通過(guò)錯(cuò)誤的造 成各種不同類型的預(yù)誘變DNA性的惡變。烷化劑可通過(guò)共價(jià)修飾46 分別和胸腺卩密唳和鳥卩票吟的錯(cuò)配結(jié)果。00損害，例如-MeT-MeG和 尤其進(jìn)行了一系列烷化劑誘變作用的定性和定量的研究。在近幾年, 是一些化合物，像乙基甲磺酸鹽、甲基甲磺酸鹽和乙基亞硝基麻，不 其誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘變量并未超過(guò)自然突變管是在體外還是在體, 下達(dá)到的劑量水平。這使人們嘗試去用定量的方法取代定性的“是或 不是”來(lái)定義劑量效應(yīng)

2、關(guān)系。其他基因毒性的耐藥性研究結(jié)果顯示, 所觀察到的臨界值是DNA修復(fù)酶的活性（例如堿基切除修復(fù)酶、烷 基轉(zhuǎn)移酶）和抗氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制的主要促成因素。烷基轉(zhuǎn)移酶可 以高保真修復(fù)預(yù)誘變加成物并在監(jiān)測(cè)基因組完整性中起到?jīng)Q定性作 用。在鼠傷寒沙門氏桿菌中存在兩種烷基轉(zhuǎn)移酶機(jī)制，一種是組成型 “鳥卩票吟轉(zhuǎn)移酶，0gt）;DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（O另一表達(dá)0-烷基鳥卩票吟 6烷基鳥卩票吟轉(zhuǎn)移酶I （Ada,即適應(yīng)性響應(yīng)）。種是可誘導(dǎo)的O在鼠傷寒沙門氏桿菌中，Ogt機(jī)制在大多數(shù)DNA修復(fù)烷基化病變的活動(dòng)中 起主要作用。然而，研究結(jié)果表示，烷化劑對(duì)Add蛋白的表達(dá)有 微 $.弱的誘導(dǎo)作用。Yamada發(fā)現(xiàn)，Am

3、es測(cè)試菌株缺少甲基轉(zhuǎn)移酶，變成 對(duì)誘變烷化劑高度敏感的菌株。近幾年來(lái)，Goeke計(jì)算出鼠傷寒沙門 氏桿菌，在EMS處理下，烷基轉(zhuǎn)移酶對(duì)DNA病變處的修復(fù)速率。計(jì)算出的修復(fù)率值約為100%的劑量水平低于所觀察到的閾值。這表 明無(wú)誤差的DNA修復(fù)是烷化劑閾值誘導(dǎo)作用的主要機(jī)制。為定量確 定烷基轉(zhuǎn)移酶對(duì)烷化劑的致突變性，在一系列的Ames試驗(yàn)中，我們 研究了緊密間隔的劑量水平的乙基甲磺酸鹽（EMS）,甲基磺酸甲酯 （MMS）,乙基亞硝基腺（ENU）,甲基亞硝基腺（MNU）,替莫卩坐胺（TMZ）。眾所周知，這些化合物可誘導(dǎo)不同形式的DNA加合6-0 鳥卩票吟、MMS誘導(dǎo)物。現(xiàn)己證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中

4、，用EMS6-G） 烷基化加合物時(shí)，濃度比較低只有2%至（03%的EMS和0.3%6-G加合物可以被MNU （5%-MMSo然而，更高濃度的011%）和6-G被至12% OENU17%）誘導(dǎo)。在細(xì)菌中，除非是在9%ENU （9% -6-G加合物是檢測(cè)不到的。不同MMS誘導(dǎo)的0處理后檢測(cè)，否則被 于EMS, MMS, ENU和MNU直接使DNA烷基化，TMZ則是通過(guò) 自發(fā)水解形成高活性的陽(yáng)離子甲基重鹽，這導(dǎo)致DNA在不同的位置 6-MEGo 0甲基化，包括誘變損傷處的DNA修復(fù)使用的野生型和缺 陷型 Ames 試驗(yàn)菌株，包fS TA1535 （Ogt+/Ada+）, YG7100 （Ogt+ /

5、Ada-）, YG7104 （Ogt-/Ada+）和 YG7108 （Ogt-/Ada-）o 值得注意 的是，TA1535核苛酸切除修復(fù)（NER）是不充分的，因此來(lái)源于 TA1535包括 YG7100,YG7104和YG7108菌株NER也是不充分的。 利用統(tǒng)計(jì)軟件包在自由軟件環(huán)境下的“R” $.下確定一個(gè)出發(fā)點(diǎn)（POD）對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析：由沃納和羅馬盧茨創(chuàng) 建的曲棍球棒模型，這將被指定在以下由Wout Slob改進(jìn)的“Lutz Lutz”和被稱為PROAST的基準(zhǔn)劑量模型中。結(jié)論ogt-缺陷株對(duì)烷化劑更敏感為了檢驗(yàn)兩種烷基轉(zhuǎn)移酶Ogt和Ada的誘導(dǎo)突變?cè)趧┝糠磻?yīng)關(guān)系上 的影響，分析了五種烷化

6、劑，包括兩種磺酸鹽（EMS, MMS）,兩種 亞硝基化合物（ENU,MMU）和替莫卩坐胺，烷基轉(zhuǎn)移酶野生型（TA1535, Ogt+/Ada+）和烷基轉(zhuǎn)移酶缺陷型（YG7104, Ogt-/Ada+； YG7100, Ogt+/Ada-； YG7108, Ogt-/ Ada+）沙門氏測(cè)試菌株。一系列的 22 個(gè)緊密間隔的濃度能確保劑量-響應(yīng)曲線非常精確，特別是在低劑量 區(qū)。由于應(yīng)變敏感性差異，TA1535, YG7100最高濃度高達(dá)5000 U g/板，而YG7104和YG7108則是低10倍的濃度。組氨酸回復(fù)突變 每板的平均值在圖表上1A-1E之間。為了呈現(xiàn)的整個(gè)劑量圍，數(shù)據(jù) 都出現(xiàn)在雙對(duì)數(shù)

7、表（對(duì)數(shù)）中。總的來(lái)說(shuō)，現(xiàn)己觀察到Ogt缺陷型菌 株比野生型菌株更敏感，而Ada的影響似乎要小的多。EMS和ENU 劑量效應(yīng)曲線幾乎是相同的，而且與Ada的狀態(tài)沒有關(guān)聯(lián)。相反，MMS和TMZ,其劑量效應(yīng)曲線類似，缺乏Ogt和Ada的細(xì)菌比那些 只含Ogt的試驗(yàn)菌株要敏感十倍。在MNU誘變實(shí)驗(yàn)中觀察到了類似 的結(jié)果。在TA1535菌株中，只有在EMS和MMS分別為2000 n g/ 板和400 ug/板的濃度時(shí)，誘導(dǎo)突變體的頻率2100回復(fù)突變體/板， 而用濃度為100 n g/板的MNU和ENU處理時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)出大量的回 復(fù)S.突變體。有趣的是，如圖2a和2b所示，在菌YG7108(Ogt-/A

8、da-) 中，MMS和EMS 1毫克/板的濃度能夠誘導(dǎo)100個(gè)回變菌落數(shù)，而 對(duì)MNU和ENU來(lái)說(shuō)，濃度分別約2.5 n g/板和7.5ug/板，才能誘 導(dǎo)YG7108類似的突變頻率。這似乎與下面要講的亞硝基化合物具 有較強(qiáng)誘變能力的概念相矛盾。TA1535(Ogt+ / Ada+)的閾值可以確定，但YG7108(Ogt/ Ada)的不 能確定。對(duì)菌株 TA1535 (Ogt+/Ada+)和 YG7108 (Ogt-/Ada-)所描述的 統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行劑量效應(yīng)曲線擬合。由于達(dá)到平衡或誘導(dǎo)毒性降低會(huì)擾 亂統(tǒng)計(jì)建模，只有在被選中的亞致死劑量圍，效應(yīng)能力才會(huì)隨著濃度 的增加而增強(qiáng)。(EMS： TA15

9、35 在 0 - 3359ug/板，YG7408 在 0 - 8.35 u g/板；MMS： TA1535 在 0 - 5000 u g/板，YG7108 在 0 - 3.5 ug/板；TM乙 TA1535 在 0-2125ug/板，YG7108 在 0-1.85 ug/ 板；ENU： TA1535 在 0-336ug/板，YG7108 在 0-25吒/板；MNU： TA1535 在 0 170ug/板，YG7108 在 0 - 30 u g/板）。女口圖 3所示，在TA1535中，所有測(cè)試的化合物的閾值都在遠(yuǎn)離零的較低 的 LutzLutz模型可靠區(qū)間（Td丄）。在這一菌株，發(fā)現(xiàn)EMS閾值使

10、最高的（1145ug/板），其次是MMS, TMZ （分別為8仃和729 ug/板，） 和ENU, MNU （分別為136、125 ug/板，見表一）。值得注意的 是，首先是MNU,在TA1535中觀察到的劑量-效應(yīng)曲線平直段閾 值達(dá)到（125ug/板）水平，緊接著就是在閾值劑量處有了一個(gè)急轉(zhuǎn) 彎。相比之下，在YG7108中，所有測(cè)試的化合物在Lutz Lutz模型 中都$.是線性劑量效應(yīng)曲線，除了 MNU和TM乙 經(jīng)計(jì)算，它們的閾值非常 的低（分別為2.8和0.16 ug/板）。因此 可以做出一個(gè)合理的假設(shè)， 所觀察到的閾值起因于甲基轉(zhuǎn)移酶Ogt和Ada有效無(wú)誤地去除小的 64烷基T。在TA

11、1535中，烷基G和0由烷基加合物如OLutz丄utz 模型計(jì)算出亞硝基化合物的閾值比磺酸鹽的閾值低得多。在YG7108 中，盡管測(cè)出的四個(gè)化合物的劑量水平非常低，但并不能排除它們， 因?yàn)橥ㄟ^(guò)EMS, MMS,與ENU測(cè)試更低的濃度，己能檢測(cè)到很小 但是可以計(jì)量的閾值。在TA1535和YG7108中，利用BMD （基準(zhǔn)劑量）計(jì)算出的劑量效 應(yīng)曲線見圖4。BMD計(jì)算出的d值（在此處指出了不合理的地方， 見研究方法部分）也和表一總結(jié)的一樣。與Lutz丄utz模型一致，在Tds非零處只存在TA1535 （除了用MNU處理的YG7108）,在TA1535測(cè)出的烷化劑d值和BMD值一般高于在YG7108

12、中所測(cè)值。 在TA1535中，觀察到MMS, EMS和TMZ的BMD最高值（分別 為 953, 831,和 858 u g/板），MNU, ENU （分別為 78 和 51 ug/ 板）（表）。有趣的是在YG7108中，MNU的BMD值（2.4mg/板） 顯著高于其他所有化合物，這表明Ogt菌株對(duì)MNU的耐藥性比較低（YG7104和YG7108）,與其他化合物中是不同的。討論：在鼠傷寒沙門氏菌中，Ogt是組成型表達(dá)，而Ada則是只在有限的圍 可誘導(dǎo)。因?yàn)樗械纳抽T氏菌菌株都是NER缺陷型，因而清除烷基 化病變的主要是Ogt。Goeke等人根據(jù)EMS的濃度計(jì)算出 了 .S.Ogt修復(fù)DNA損你無(wú)

13、差錯(cuò)）的成功率?？傄褹mes測(cè)試菌株TA1535（Ogt+/Ada+）和丫G7104 （Ogt-/Ada+）經(jīng) EMS 處理后的劑量效 應(yīng)曲線，是由Goeke等人使用基準(zhǔn)劑量模型進(jìn)行擬合（PROAST） 的。通過(guò)比較兩種在不同的EMS濃度下由Ogt系統(tǒng)無(wú)錯(cuò)誤修復(fù)的菌 株，可預(yù)估到結(jié)果。作者的結(jié)論是隨著EMS濃度降低錯(cuò)誤的修復(fù)率 接近于零。在我們目前的研究中，己經(jīng)擴(kuò)大到四種烷化劑，ENU, MMS, MNU和TMZ,但主要集中在評(píng)估劑量反應(yīng)關(guān)系對(duì)DNA修復(fù) 的影響。不同化合物的誘變效力是通過(guò)比較它們的PoDs來(lái)進(jìn)行評(píng)估, 這是通過(guò)曲棍球棒或閾值（TD）模型和基準(zhǔn)劑量（BMD）的方法計(jì) 算的。Og

14、t缺乏時(shí)，Ada有選擇的修復(fù)甲基化DNA但不修復(fù)乙基化DNA 與親木菌株TA1535 (Ogt+/Ada+)相比，只含有Ogt缺乏Ada的菌 株，它的敏感性并沒有顯著改變。這細(xì)微的差異可能是由于生物變異。 然而，在沒有Ogt鼠傷寒沙門氏菌中，同樣也缺乏Ada (YG7108, Ogt-/Ada-比那些含有 Ada 的菌株(YG7104, Ogt-/Ada+)對(duì)甲基化(MMS,MNU,TMZ)更為敏感。這與山田等人1997 得出的結(jié)果一致，這表明比起乙基化加合物，Ada會(huì)優(yōu)先修復(fù)甲基化 66-MeTo此外，在OgtO缺乏，用乙基加合物，如O加合MeG和 物和甲基加合物處理后，Ada對(duì)甲基加合物的

15、特異性，可能會(huì)更明 顯。對(duì)這些加合物的含量與分布的進(jìn)一步研究將有助于闡明我們觀察 到的誘變差異研究。亞硝基腺類的閾值在TA1535中比烷基磺酸鹽的閾值低，但在S.YG7108中其閾值卻比烷基磺酸鹽的閾值高。6-G 一般其誘導(dǎo)的高度突變的O 烷基磺酸鹽與亞硝基化合物相比, 6G加合物百分比：ENU MNU EMS MMS加合物較少(O)。與我們的實(shí)驗(yàn)相符的是，在TA1535中這兩種磺酸鹽(EMS、MMS) TD值均高于亞硝基化合物(ENU, MNU)的TD值。在大鼠Pig-a 基因突變的研究中，EMS對(duì)紅細(xì)胞CD592突變體誘導(dǎo)閾值為 22mg/kg/dayo同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明EMS的劑量

16、在每日低于 25mg/kg/day （骨髓和胃腸道）和50mg/kg/day （肝）時(shí)LacZ基因 突變是不可誘導(dǎo)的。在最近我們的Pig-a研究證實(shí)，紅細(xì)胞CD592 突變體的經(jīng)MMS誘導(dǎo)的閾值為8mg/kg/day。相反,在Pig-a實(shí)驗(yàn)中， 兩種亞硝基腺類化合物 ENU（0.9mg/kg/day）和 MNU（2.5mg/kg/day） 的閾值則很低。在丫G7108中，EMS, MMS,與ENU的Tds值不可計(jì)算，只能計(jì)算出MNU的TD值為2.8ug/板。此外，磺酸鹽EMS和MMS 的BMD值均低于相應(yīng)的亞硝基化合物ENU和MNUBMD值。這些 結(jié)果表明，磺酸鹽在雙缺失菌株中比亞硝基化合物更

17、有效，其比亞硝 基化合物對(duì)野生型細(xì)菌具有更高的致突變性。意想不到的是，在 YG7108菌株中，磺酸鹽具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng)，劑量與高度誘變的 GO加合物的相對(duì)頻率無(wú)關(guān)。這讓我們假設(shè)，在雙野生型菌株中， 其他DNA加合物可能會(huì)促成突變效應(yīng)。N7鳥瞟吟加合物（N7G） 6-G0加合物更高的水平（最高的經(jīng)烷化劑處理后被誘導(dǎo)達(dá)到比MMS, 即85%左右，最低的ENU,即在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中15%）o .5.G加合物的誘變少得多。N7-G加合物誘變比O然而，人們通常認(rèn) 為此外，在雙缺失株（YG7108）中，磺酸鹽的相對(duì)效力也恢復(fù)了。 雖然在雙野生型菌株（TA1535）中，計(jì)算出EMS、MMS的PoD值 非常相似（EMS的TD值略高于MMS的，但兩種化合物的BMD值 幾乎相同），在雙缺失株（YG7108）中，計(jì)算出MMS的BMD值（0.07ug/板)大大低于EMS (0.32 ug/板)的BMD值。然而，對(duì)于亞硝 基化合物來(lái)說(shuō)，ENU的PoD值始終低于MNU的PoD值。負(fù)責(zé)效 力逆