唐山師范學(xué)院綜合性-設(shè)計(jì)性試驗(yàn)項(xiàng)目申報(bào)表

1、2007 年 月 日唐山師范學(xué)院 綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目申報(bào)表申報(bào)單位名稱： 生命科學(xué)系實(shí)驗(yàn)項(xiàng) 目名稱唾液淀粉酶活性分析實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)綜合性設(shè)計(jì)性所屬課程生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 開設(shè)學(xué)期第 3 學(xué)期綜合 /設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)數(shù) 5實(shí)驗(yàn)室 名稱生物化學(xué)及植物生理 學(xué)實(shí)驗(yàn)室地點(diǎn)5401每組人數(shù) 4項(xiàng)目負(fù) 責(zé)人李春香聯(lián)系 電話經(jīng)費(fèi)預(yù)算（元）500詳細(xì)說明該 實(shí)驗(yàn)涉及哪 些知識(shí)點(diǎn)1、 唾液淀粉酶的制備2、 環(huán)境條件對唾液淀粉酶活性的影響3、 唾液淀粉酶的專一性4、 唾液淀粉酶活性的測定參加實(shí)驗(yàn)指 導(dǎo)人員李春香、張淑紅、高鳳菊實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目建 設(shè)進(jìn)度安排2007 年 6 月：申報(bào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目2007年 6月2007年 9月：準(zhǔn)備

2、試驗(yàn)材料及儀器，完善各項(xiàng)準(zhǔn)備工作2007 年 10 月：首次開設(shè)試驗(yàn)項(xiàng)目，進(jìn)行效果分析主要儀 器設(shè)備分光光度計(jì) 恒溫水浴鍋 電爐實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及 擬達(dá)到的培 養(yǎng)目標(biāo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：學(xué)生自制唾液淀粉酶，分析影響唾液淀粉酶活性的環(huán)境條件，并在得出的最適 條件下測定唾液淀粉酶的活性。培養(yǎng)目標(biāo)：通過實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的學(xué)習(xí)，使學(xué)生從整體掌握酶學(xué)的基本知識(shí)以及測定酶活性的基 本思路和方法；通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問題的能力。系論證 意見系主任簽名： （蓋章） 年月日主管部門 意見（蓋章）年月日綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)書 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：唾液淀粉酶活性分析張淑紅 編 寫適用專業(yè)： 生物科學(xué) 生物技術(shù)唐山師

3、范學(xué)院生命科學(xué)系2007年 5 月實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)： 5 學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型：綜合性每組人數(shù)： 5 人組一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)， 使學(xué)生掌握酶學(xué)的基本知識(shí)，特別是唾液淀粉酶酶活性的測定 方法。2、通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問題的能力，為今后的學(xué)習(xí)和科研工作奠 定基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、影響酶促反應(yīng)的因素淀粉受唾液淀粉酶的作用水解成麥芽糖和少量葡萄糖。 通常以測定淀粉水解的程度 （底 物減少）或麥芽糖生成的數(shù)量（產(chǎn)物增加）來衡量淀粉酶的活性。淀粉經(jīng)淀粉酶水解后得 到分子大小不相同的糊精， 糊精遇碘生成不同的顏色。 隨著糊精分子量的降低依次為藍(lán)色、 紫色、暗褐色或紅色、無色。酶的活性受溫度的雙

4、重影響。低溫時(shí)酶活性表現(xiàn)較低，在一定范圍內(nèi)，酶活性隨溫度 上升而增高。通常每升高 10，反應(yīng)速度增加一倍左右；另一方面，溫度越高使酶蛋白變 性越快，致使酶活性隨溫度上升而降低，以致完全喪失活性。當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值 時(shí)的溫度，稱為酶作用的最適溫度。 本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶對淀粉的水解作用為例， 觀察 0、 37和 100 三種溫度對酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)中各管除溫度外，其它反應(yīng)條件皆相同。唾 液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成各種不同大小的糊精及麥芽糖。它們遇碘呈現(xiàn)不同的顏色 反應(yīng)，故可利用碘反應(yīng)的顏色對比來判定不同溫度下酶活性的大小。酶的活性受環(huán)境 pH 的影響極為顯著。 因 pH 影響酶蛋白和底物的

5、解離狀態(tài)， 從而明顯 改變酶與底物的結(jié)合和催化作用。 每一種酶在一定的條件下都有它發(fā)揮作用的最適 pH，此 時(shí)酶的活性最大。當(dāng)其它條件相同時(shí)，離最適 pH 越近，其活性越大，即所催化的反應(yīng)速 度越快。本實(shí)驗(yàn)利用唾液淀粉酶對淀粉的水解作用，在其它條件相同時(shí)，對比觀察 pH 變 化對酶活性的影響，用碘反應(yīng)判斷結(jié)果。另外激活劑和抑制劑對酶活也具有一定的影響， 能增高酶活性的物質(zhì)稱為酶的激活劑， 能降低酶活性卻又不使酶變性的物質(zhì)叫酶的抑制劑。2、酶作用的專一性麥芽糖和葡萄糖都具有還原性，能使班氏試劑中的二價(jià)銅離子（Cu2+）還原成一價(jià)銅離子（Cu+）生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。而蔗糖不能被水解也不具有還

6、原性，故不能被班 氏試劑還原。利用此性質(zhì)可以檢測唾液淀粉酶的專一性。3、酶活性的測定酶活力也稱酶活性，是以在最適溫度、 最適 pH 等條件下，催化一定的化學(xué)反應(yīng)的初速 度來表示。本實(shí)驗(yàn)是以一定量的唾液淀粉酶液在實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件下，在一定的初始時(shí) 間里將淀粉還原為還原糖，然后通過與 DNS 試劑作用，比色測定，求得還原糖的生成量， 從而計(jì)算出酶反應(yīng)的初速度，即酶的活力。這里規(guī)定，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘水解淀粉 生成 1mg 還原糖作為一個(gè)淀粉酶活力單位，記為 1U。在 NaOH 和丙三醇存在下， 3,5二硝基水楊酸（ DNS ）與還原糖共熱后被還原生成氨 基化合物。在過量的 NaOH 堿性溶液

7、中此化合物呈桔紅色，在 540nm 波長處有最大吸收， 在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含 糖量。三、實(shí)驗(yàn)方案（一）唾液淀粉酶的制備1、每人取一個(gè)干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。2、先用蒸餾水漱口，將口腔內(nèi)的食物殘?jiān)宄蓛簟?、口含約 5mL 蒸餾水，做咀嚼動(dòng)作 12min，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾 液吐入一個(gè)干凈的小燒杯中。稀釋至 100mL，備用。（二）溫度對酶活性的影響1、準(zhǔn)備好 37水浴、冰水浴及沸水浴，白瓷板中加碘液備用。2、取小試管 4支，編號，各加 1%淀粉溶液 30 滴，pH 6.8緩沖液 10 滴。 1號管做對照， 2號管放

8、37水浴， 3號管放冰水浴， 4 號管放沸水浴中，各預(yù)溫 10min3、向1號管加蒸餾水 10滴，向2、3和4號管各加稀釋唾液 10滴，混勻，仍放原水浴中。4、5min 后由 2 號管每隔一定時(shí)間（ 1 或 2min），取液一滴于白瓷凹板上做碘反應(yīng)，觀 察并記錄顏色變化情況，到碘反應(yīng)接近淺紅色時(shí)，取出各管，包括 1 號管，分別各取 1 滴 做碘反應(yīng)，觀察對比結(jié)果。5、把4支試管均放入 37水浴中，510min 后取出，向各管內(nèi)加碘液 2滴，混勻，觀察 結(jié)果。綜合分析所測三種溫度下的酶活性情況，并以 1 號管為對照說明冰水浴及沸水浴兩溫 度對酶活性影響的異同，得出唾液淀粉酶的最適反應(yīng)溫度。（三）

9、pH 對酶活性的影響 1、白瓷板中加碘液備用，準(zhǔn)備好 37水浴。2、取小試管 4 支，編號，按下表加入試劑，混勻。管號12341%淀粉（ d）303030300.1mol/L 磷酸鹽緩沖液（ d）10101010(pH5.0)(pH6.8)(pH 8)(pH6.8)3、4號管加稀釋唾液 10滴, 放 37水浴中，記時(shí)，每隔 1由第 4號試管中取出 1滴 溶液做碘反應(yīng)，待碘反應(yīng)呈淺紅色或橙黃色時(shí)，取出試管，記錄保溫時(shí)間。4、13號試管放入 37水浴中，以 1min 間隔，并記錄時(shí)間，依次向 1至 3號管中加 入稀釋唾液 10滴，搖勻，按照 4號管的保溫時(shí)間，以 1min 間隔，依次取出各管，并立

10、即 加碘液 2滴，混勻。觀察各管呈現(xiàn)的顏色，判斷在不同 pH 下淀粉被水解的程度，分析 pH 對淀粉酶活性的影響，并確定其最適 pH。（四）取 4 支試管，按下表編號后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。管號12340.1% 淀粉溶液（ d）30303030稀釋的新鮮唾液（ d）101010101% NaCl 溶液（ d）101% CuSO4 溶液( d)101% Na2SO4 溶液（ d） 蒸餾水（ d）KI I2溶液（ d） 現(xiàn)象37恒溫水浴中保溫 10min102310232323酶的專一性取試管 3 支，編號，按下表操作：管號1231%淀粉 （ d）10101% 蔗糖 （d）10pH6.8 緩沖液 （d）101

11、010稀釋唾液 （ d）55煮沸的唾液 （ d）5各管混勻后，置37水浴中保溫 10min班氏試劑（ d）202020將上述各管放沸水浴中煮沸 35 分鐘, 觀察結(jié)果。六）唾液淀粉酶活性的測定1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取 6 支試管，按下表加入 1.0mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水項(xiàng)目空白12345葡萄糖溶液（ mL ）00.20.30.40.50.6蒸餾水（ mL ）32.82.72.62.52.4葡萄糖的濃度 （mg/mL）01/151/102/151/63/15加熱沸水浴加熱5 分鐘冷卻立即用冷水冷卻光密度（ OD 540 ）取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，在 540nm 波長處測定光吸收值。以葡萄糖

12、含量（ mg/mL ） 為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、唾液淀粉酶活性的測定1234最適 pH 值緩沖液（ mL ）11111淀粉溶液 0.3%NaCl（ mL）1111唾液淀粉酶（ mL ）1110蒸餾水（ mL ）0001酶促反應(yīng)搖勻，最適溫度下水浴 5minDNS 試劑（ mL ）2222顯色反應(yīng)沸水浴5min取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，稀釋一定倍數(shù)，搖勻，在 540nm 波長處測定光吸收值。測 定后，取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖含量，計(jì)算酶的活性。四、主要儀器及試劑（一）試劑1、1%淀粉2、0.1mol/L pH5-8 磷酸鹽緩沖液：分別配制下列二液，再按下表

13、混合后加水稀釋一倍 即可。（1）0.2mol/L NaH 2PO4液：稱取 NaH2PO42H2O 31.2g ，加水準(zhǔn)確定溶至 1000mL。（2）0.2mol/L Na2HPO412H2O 71.64g ，加水準(zhǔn)確定溶至 1000mL。pH0.2mol/L NaH 2PO4 (mL)0.2mol/L Na 2HPO4 (mL)598.11.96.851.049.085.394.73、碘液：碘化鉀 1g 加少許水溶解后，再加碘 0.5g，溶后加水至 100mL，混勻。用時(shí) 加水稀釋 10 倍。4、0.1% 淀粉溶液5、1% NaCl 溶液6、1% CuSO4溶液7、1% Na2SO4溶液8、

14、1% 蔗糖9、班氏試劑：檸檬酸鈉 173g和碳酸鈉 100g溶于約 700mL 水中，另將硫酸銅 17.3g 溶于 100mL 水中?？煞謩e加熱助溶。冷卻后將兩液混合，再加水至 1000mL 混勻。10、3,5二硝基水楊酸（ DNS）試劑：稱取 6.5g DNS 溶于少量熱蒸餾水中， 溶解后移入 1000mL 容量瓶中，加入 2mol/L 氫氧化鈉溶液 325mL，再加入 45g 丙三 醇，搖勻，冷卻后定容至 1000mL。11、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖 100mg，加少量蒸餾水溶解 后，以蒸餾水定容至 100mL，即含葡萄糖為 1.0mg/mL。12、1%淀粉 0.3NaCl（二）儀器水浴鍋；電爐；分光光度計(jì)五、實(shí)驗(yàn)要求要求學(xué)生預(yù)習(xí)生物化學(xué)教材中酶學(xué)一章的內(nèi)容，特別是影響酶促反應(yīng)因素一節(jié)。并且 查閱資料了解 DNS 法測定還原糖的原理。六、思考題1、比色時(shí)為什么要設(shè)計(jì)空白管？2、進(jìn)行酶學(xué)實(shí)驗(yàn)必須注意控制哪些條件？為什么？七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告是實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和匯報(bào)， 通過實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作可以分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)和問題， 學(xué)會(huì)處理各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法，加深對生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的理解和掌握，同時(shí)也是學(xué)習(xí)撰寫科 學(xué)研究論文的過程。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式應(yīng)為：1