4751.茶葉提取物抗補(bǔ)體活性初步研究 論文

1、畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)）題 目 茶葉提取物抗補(bǔ)體活性初步研究 指導(dǎo)老師 專業(yè)班級(jí) 生物技術(shù)及應(yīng)用0701 姓 名 學(xué) 號(hào) 2010年 5 月 30 日摘要 在8種植物提取物中篩選出一種有較好抗補(bǔ)體活性成分植物（茶葉），然后再對(duì)該植物進(jìn)行活性成分濃度與抗補(bǔ)體活性效果關(guān)系研究，以便為茶多酚新用途提供參考。研究主要利用超聲波對(duì)植物抗補(bǔ)體活性成分提取制備，再運(yùn)用抗補(bǔ)體溶血活性檢測(cè)方法篩選與檢測(cè)具有抗補(bǔ)體活性成分植物和抗補(bǔ)體活性效果；研究結(jié)果表明，8種植物中杭白菊和綠茶具有較好的抗補(bǔ)體活性成分，粗提物溶血活性ch50檢測(cè)值分別為0.152、0.535mg/ml，對(duì)茶多酚分離提純后三個(gè)成分98%茶多酚（eg

2、cg為45%）、egcg及咖啡堿的溶血活性ch50檢測(cè)值分別為0.353、0.451mg/ml，咖啡堿沒(méi)有抗補(bǔ)體活性效果；由此可以初步得出茶多酚為較好的抗補(bǔ)體活性成分，但抗補(bǔ)體活性效果的主導(dǎo)成分不是egcg，而且粗提物抗補(bǔ)體活性更好。關(guān)鍵詞：茶多酚；抗補(bǔ)體活性；溶血活性檢測(cè)；茶葉；清熱解毒目 錄引言.11材料.21.1實(shí)驗(yàn)材料.21.2實(shí)驗(yàn)試劑.21.3實(shí)驗(yàn)儀器.22方法.22.1八種植物提取物制備.22.2茶葉抗補(bǔ)體活性成分分離.22.3補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性(ch50)測(cè)定.22.3.1溶液配制.32.3.2補(bǔ)體制備及效價(jià)測(cè)定.32.3.3藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定. 33.結(jié)果與分析.3

3、3.1八種植物提取效果的比較.43.2八種植物抗補(bǔ)體初步篩選.43.3茶葉抗補(bǔ)體活性測(cè)定結(jié)果.44. 結(jié)果與討論.5參考文獻(xiàn).7引言補(bǔ)體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一。補(bǔ)體系統(tǒng)的正常激活在消滅外來(lái)微生物、清除肌體內(nèi)損傷或死亡的細(xì)胞和組織以及維持機(jī)體的平衡中起著重要的作用。與補(bǔ)體激活相關(guān)的疾病如心肌死、腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、sars等，均是發(fā)病群體數(shù)量巨大、危害性強(qiáng)的疾病。目前臨床上廣泛使用的糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑雖然對(duì)某些與補(bǔ)體過(guò)度激活相關(guān)的疾病有一定治療作用，但由于該類藥并非專一的補(bǔ)體抑制劑，選擇性差，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)降低機(jī)體的防御機(jī)能，產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥。因此臨床上急需高效低毒專一的新型補(bǔ)

4、體抑制劑。國(guó)內(nèi)外已完成部分天然產(chǎn)物的篩選，發(fā)現(xiàn)自然界中廣泛存在的某些多糖、黃酮、甾類掃萜類化合物具有顯著的抗補(bǔ)體活性。本文將對(duì)幾種天然產(chǎn)物類抗補(bǔ)體活性成分的測(cè)定1。自然界中廣泛存在具有抗補(bǔ)體作用的活性成分，直接從植物中研究開(kāi)發(fā)天然補(bǔ)體抑制成分的成本低，且大多數(shù)活性成分作為藥用植物的一部分可以直接被機(jī)體消化吸收，因此天然產(chǎn)物中高教低毒的新型補(bǔ)體抑制劑的研究與開(kāi)發(fā)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)著的廣泛關(guān)注。 茶葉中含有大量的茶多酚，茶多酚是茶葉中具有生物活性的重要成分之一，是一類存在于茶葉中的多羥基酚性化合物的混合物。研究表明，茶多酚不僅是一種天然的無(wú)毒抗氧化劑，也是一種理想的天然藥物，具有多種保健功能和藥理作用，

5、可以清除自由基，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗紫外線照射、防治心血管病、除臭、延緩衰老、抗齲護(hù)齒、抗腫瘤、多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)和抗輻射等作用。杭白菊為“浙八味”之一。其作為一常用藥具有疏風(fēng)清熱、平肝明目的功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，杭白菊主要含有黃酮類化合物、揮發(fā)油、綠原酸、維生素等成分，其中杭白菊總黃酮2。豆腐柴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功能清熱解毒、消腫止血等功效，民間常用來(lái)治療蛇毒咬傷、無(wú)名腫毒、創(chuàng)傷出血等。不僅僅是以上這幾種植物，從文獻(xiàn)中得知麥冬、溫郁金、這些“浙八味”還有蘆薈、鴨趾草、艾草等植物，均具有清涼解毒，抗自由基等作用。1材料

6、1.1實(shí)驗(yàn)材料麥冬、溫郁金、鴨趾草，購(gòu)于杭州新城醫(yī)院；杭白菊、綠茶、蘆薈，購(gòu)于下沙物美超市；豚鼠，新西蘭兔，上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供：1.2實(shí)驗(yàn)試劑bbs、2%srbc、巴比妥、溶血素、30%的酒精。1.3實(shí)驗(yàn)儀器微波提取器（njl07-3，實(shí)驗(yàn)室專用微波爐）；低溫高速離心機(jī)(jonan mr22i型， jouan公司，法國(guó))；酶標(biāo)儀(well scan mk3，thermo labsystems公司，芬蘭)；恒溫振蕩器(wmzk 8002，上海醫(yī)用儀器廠)；冷凍干燥器(freezedryerl8型，labconco公司，美國(guó)；2方法2.1八種植物提取物制備3稱取綠茶250g用微波真空提?。?/p>

7、80-90，時(shí)間:30min，料液比1:10）提取兩次合并濾液抽濾用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏狀放到干凈的鋁盒真空干燥。豆腐柴、麥冬、溫郁金、杭白菊、蘆薈、艾草、鴨趾草，7種提取方法同綠茶提取方法相同。2.2 茶葉抗補(bǔ)體活性成分分離4稱取綠茶500克30%酒精超聲提取兩次，每次30分鐘過(guò)濾離心孔徑0.45m微孔濾膜過(guò)濾截留分子量5000及1000超濾膜過(guò)濾濃縮大孔樹(shù)脂吸附不用濃度的酒精溶液洗脫濃縮、凍干茶多酚固體檢測(cè)。2.3 補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性(ch50)測(cè)定2.3.1溶液配制5,6 巴比妥緩沖液配制：先配制出5倍濃縮巴比妥緩沖液(5bbs)。使用時(shí)稀釋成巴比妥緩沖液(bbs)。2羊紅細(xì)胞(srb

8、c)配制：取綿羊血2ml，用bbs洗滌，800r/min，離心3min，重復(fù)3次后，再3000r/min。離心10min壓積，然后用bbs配成2%srbc。1:1000溶血素配制：用bbs配制成1:1000溶血素溶液。綠茶溶液配制：稱取茶多酚4mg，用bbs超聲溶解成1:1溶液(5mg/ml)，加bbs對(duì)倍稀釋配成1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128共8個(gè)濃度的供試品溶液。2.3.2補(bǔ)體制備及效價(jià)測(cè)定7,9豚鼠股動(dòng)脈取血約10ml，4放置1h凝固后，800r/min，離心5min，取血清，加入以bbs洗滌后的2%srbc約2ml，混勻后，800r/min，離心5mi

9、n，取上清液作為補(bǔ)體分裝，-70冷凍保存?zhèn)溆?。補(bǔ)體經(jīng)典溶血系統(tǒng)的建立：取補(bǔ)體(豚鼠血清)0.1ml，加入bbs配制成1:10溶液，用bbs對(duì)倍稀釋成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280溶液。取1:1000溶血素、各濃度補(bǔ)體及2%srbc各0.1ml溶于0.3mlbbs中，混勻，37水浴30min后，在5000r/min，4條件下離心10min分別取上清0.2ml ，在405nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組(0.1ml2%srbc溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率。以補(bǔ)體稀釋度為x 軸，溶血百分率為y軸作圖。選

10、擇達(dá)到高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度。2.3.3藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測(cè)定10,11 取確定的臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按照表1加入適量bbs、溶血素和2 % srbc。37水浴30min 后，5000r/min，4條件下離心10min后分別取每管上清液0.2ml，用酶標(biāo)儀在405nm下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置8種提取物對(duì)照組，補(bǔ)體組和全溶血組。3. 結(jié)果與分析3.1八種植物提取效果比較 通過(guò)八種植物的提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有的提取物很粘（如溫郁金）不容易過(guò)濾，有的干燥后的質(zhì)量不是大，在對(duì)比之下要選著，容易過(guò)濾，干燥后質(zhì)量較大的。提取物干燥后的質(zhì)量比較如表3.1。表3

11、.1 八種植物提取物干燥后的質(zhì)量比較植物名稱鋁盒重量（g）干燥后鋁盒重量（g）提取物質(zhì)量（g） 豆腐柴37.853044.31296.4599麥冬46.311551.69575.3842溫郁金46.238057.784611.5466杭白菊16.551722.40485.8531蘆薈34.879235.09041.7888綠茶34.302038.02293.7209艾草37.69840.12382.4258鴨趾草33.848235.98392.1357對(duì)比表格中得出溫郁金、豆腐柴、麥冬、綠茶的提取物重量較大，但是考慮到溫郁金、豆腐柴、麥冬這三種濃縮液較粘，不易過(guò)濾。3.2八種植物抗補(bǔ)體活性初步

12、篩選 在八種植物提取物的提取和干燥后，然后再對(duì)這幾種植物提取物進(jìn)行抗補(bǔ)體活性進(jìn)行分析，驚奇的發(fā)現(xiàn)只有綠茶和杭白菊具有抗補(bǔ)體活性，但是茶多酚的抗補(bǔ)體活性為0.152mg/ml，杭白菊的抗補(bǔ)體活性為0.535mg/ml，相比之下茶多酚的活性較為理想。3.3茶葉抗補(bǔ)體活性的測(cè)定結(jié)果在對(duì)綠茶提取進(jìn)行分離檢測(cè)后得到：茶多酚含量為98%，egcg含量為45%。試驗(yàn)的同時(shí)把粗提取的茶多酚和純的egcg還有咖啡堿也進(jìn)行了抗體活性的檢測(cè)。結(jié)果如表3.2、3.3、3.4。表3.2茶多酚經(jīng)典途經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補(bǔ)體茶多酚溶血素2%srbc茶多酚測(cè)定0.2- 0.10.3530.10

13、.1茶多酚對(duì)照0.5-補(bǔ)體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1表3.3egcg經(jīng)典途經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補(bǔ)體egcg溶血素2%srbcegcg測(cè)定0.2- 0.10.4510.10.1egcg對(duì)照0.5-補(bǔ)體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1表3.4咖啡堿經(jīng)典途經(jīng)溶血實(shí)驗(yàn)中所加各成分的體積(ml)分組bbs三蒸水補(bǔ)體咖啡堿溶血素2%srbc咖啡堿測(cè)定0.2- 0.1-0.10.1咖啡堿對(duì)照0.5-補(bǔ)體組 0.3- 0.1-0.10.1全溶血組-0.5-0.1從表格中得出茶多酚的egcg含量為43%，抗補(bǔ)體活性為0.3

14、53mg/ml，純的egcg是0.451mg/ml，咖啡堿則為0mg/ml次發(fā)現(xiàn)并不是egcg的含量越高抗體的活性越大。4 總結(jié)與討論在八種植物提取物中篩選出一種有較好抗補(bǔ)體活性成分植物（茶葉），然后再對(duì)該植物進(jìn)行活性成分濃度與抗補(bǔ)體活性效果關(guān)系研究，以便為茶多酚新用途提供參考。研究主要利用超聲波對(duì)植物抗補(bǔ)體活性成分提取制備，再運(yùn)用抗補(bǔ)體溶血活性檢測(cè)方法篩選與檢測(cè)具有抗補(bǔ)體活性成分植物和抗補(bǔ)體活性效果；研究結(jié)果表明，8種植物中杭白菊和綠茶具有較好的抗補(bǔ)體活性成分，粗提物溶血活性ch50檢測(cè)值分別為0.152、0.535mg/ml，對(duì)茶多酚分離提純后三個(gè)成分98%茶多酚（egcg為45%）、eg

15、cg及咖啡堿的溶血活性ch50檢測(cè)值分別為0.353、0.451mg/ml，咖啡堿沒(méi)有抗補(bǔ)體活性效果；由此可以初步得出茶多酚為較好的抗補(bǔ)體活性成分，但抗補(bǔ)體活性效果的主導(dǎo)成分不是egcg，而且粗提物抗補(bǔ)體活性更好。一開(kāi)始總以為具有抗自由基、抗輻射、抗自由基的egcg在抗補(bǔ)體活性中占主導(dǎo)地位，試驗(yàn)的結(jié)果推翻了原有的想法，而綠茶在本次試驗(yàn)中得出被認(rèn)為是具有較好的抗補(bǔ)體活，同時(shí)它的抗補(bǔ)體活性的具體跟什么有關(guān)，我的猜想是跟茶多酚的濃度、還是茶葉里面的其他有效成分有關(guān)，有待于具體研究，同時(shí)我也希望有人能對(duì)他的作用靶點(diǎn)和具體機(jī)制待進(jìn)一步試驗(yàn)闡明。自然界中廣泛存在有較強(qiáng)抗補(bǔ)體作用的活性成分，種類多樣，結(jié)構(gòu)各

16、異，直接從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)的補(bǔ)體抑制劑還有成本低的優(yōu)點(diǎn)，但本文得出來(lái)了并不是所有的天然產(chǎn)物都具有抗補(bǔ)體活性，但有些植物確實(shí)具有較好的抗補(bǔ)體活性，此外，大多數(shù)活性成分作為藥用植物的一部分可以直接被機(jī)體消化吸收，說(shuō)明從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)出高效、低毒的補(bǔ)體抑制劑是可能的，預(yù)示著天然產(chǎn)物類補(bǔ)體抑制劑將有良好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1章蘊(yùn)毅，張建文，陳道峰天然產(chǎn)物中的抗補(bǔ)體活性成分j中國(guó)天然藥物，2007，5(5)：322-3252馬榮粒，黃叢林茶用菊花研究進(jìn)展j北方園藝，2009，102(8)：151-1543王文平，李琳野木瓜水溶性多糖的分離提取純化及其抗體活性研究j貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31(1)：120-1234陳鶴立高效液相色譜法測(cè)定茶葉中茶多酚及咖啡堿含量j福建醫(yī)藥雜志，2006，8(1)：80-815王黔云，熊郁良眼鏡蛇毒高活性抗補(bǔ)體因子的體外溶血活性研究j中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，19(8)：909-9136吳顏，吳甘霖半支連多糖抗補(bǔ)部體活性研究