【精品】藥學(xué)本科畢業(yè)論文

1、中國(guó)藥科大學(xué)本科生畢業(yè)論文中國(guó)藥科大學(xué)本 科 畢 業(yè) 論 文論文題目 丹參酮a磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 英文題目 separation of microimpurity and identification of sodium tanshinone a sulfonate 專 業(yè) 中藥學(xué) 院 部 中藥學(xué)院 學(xué) 號(hào) 0543423 姓 名 指導(dǎo)教師 副教授 課 題完成場(chǎng)所 中藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室 論文工作時(shí)間： 2009 年 3月 至 2009年 6月丹參酮iia磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定目 錄摘要3前言5第一章 文獻(xiàn)綜述61.1 丹參形態(tài)61.2 丹參的化學(xué)成份及其藥理作用71.

2、3 丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用及研究現(xiàn)狀8第二章 原料藥中微量成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定132.1 實(shí)驗(yàn)方法132.1.1實(shí)驗(yàn)儀器132.1.2實(shí)驗(yàn)試劑132.1.3原料藥中微量成分的分離132.2 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定15參考文獻(xiàn)17致謝18丹參酮iia磺酸鈉微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定0543423 李志奇摘要：丹參酮iia磺酸鈉，是從藥材丹參中提取的主要脂溶性有效成分丹參酮iia經(jīng)磺化反應(yīng)后形成的一種水溶性鈉鹽，由于磺酸基的引入，提高了丹參酮iia的水溶性，在治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病方面顯示出與丹參酮iia所無法比擬的優(yōu)越性，成為主要的心血管類中藥。目前從丹參中提取丹參酮iia的方法和

3、藥理活性研究較多，但對(duì)于丹參酮iia磺酸鈉雜質(zhì)的研究很少，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究還是空白。在對(duì)丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用，在藥物代謝動(dòng)力學(xué)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的制備工藝等進(jìn)行綜合考察的基礎(chǔ)上本課題采用色譜及波譜方法對(duì)丹參酮iia磺酸鈉進(jìn)行微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)，本文建立了高效液相色譜法測(cè)定原料藥丹參酮a磺酸鈉微量成份含量的方法，可用來對(duì)原料藥和制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：羥基丹參酮iia磺酸鈉；丹參酮iia磺酸鈉；丹參酮iia；分離；結(jié)構(gòu)鑒定 separation of microimpurity and identification of sodium tanshinone iia s

4、ulfonateabstract: salvia miltiorrhiza is one of the most important tradition chinese medicinal materials that possess the function of both promoting blood flow and removing blood stasis with anti-coronary artery disease. the consumed quantity only in the aspect of injection has been exceeded 2 billi

5、on dosages every year. however, because the undetermined active ingredients and relaxed index of quality control induced the instable effects of clinic traterment, and, moreover, usually adverse functions, which lead salvia miltiorrhiza unable to accommodate requirement of contemporary chinese medic

6、inal materials melting world. sulfotanshinone sodium is asodium chloride of water-solubility after sulfonating tanshinone iia of liposolubility active ingredien tabstraeted in salvia miltiorrhiza.it is an effective medicine of angiocardiopathy to treat coronary artery disease, anginacordis，and myoca

7、rdial infarction.the amount of clincal utilization continuous.increasing with the high proportion of patients of angiocardiopathy induces raw material resource of salvia miltiorrhiza insufficient in china. so it becomes an extensive focus point in fharmaceutical factory that sufficient utilize and c

8、ut down uymost dissipation resource of salvia miltiorrhiza.keywords:1-hydroxy-tanshinone iia sulfonate ; sodium tanshinonea sulphonate(sts);tanshinoneiia;separation;identification 前言丹參是活血化淤的傳統(tǒng)中藥，具有良好的抗冠心病等作用。其制劑及復(fù)方制劑品種繁多，僅注射劑的年使用量就達(dá)20億支以上，但多數(shù)產(chǎn)品有效成分不明確，質(zhì)量控制指標(biāo)不嚴(yán)格，由此導(dǎo)致臨床療效不穩(wěn)定，不良反應(yīng)時(shí)常出現(xiàn)，因此不能適應(yīng)中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化和向國(guó)際

9、市場(chǎng)挺進(jìn)的要求。丹參酮iia磺酸鈉，是從藥材丹參中提取的主要脂溶性有效成分丹參酮iia經(jīng)磺化反應(yīng)后形成的一種水溶性鈉鹽，由于磺酸基的引入，提高了丹參酮iia的水溶性，在治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病方面顯示出與丹參酮iia所無法比擬的優(yōu)越性，成為主要的心血管類中藥11。由于我國(guó)心血管疾病患者在人群中比例居高不下，該藥品市場(chǎng)需求量呈逐年增加趨勢(shì)，但是因?yàn)槠潆s質(zhì)不明確，安全問題一直是制藥企業(yè)關(guān)心的問題。目前從丹參中提取丹參酮iia 的方法和藥理活性研究較多，但對(duì)于丹參酮iia磺酸鈉雜質(zhì)的研究很少，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究還是空白，且對(duì)雜質(zhì)分離也沒有一個(gè)統(tǒng)一較好的方法。由于丹參酮iia磺酸鈉是

10、丹參提取物經(jīng)過化進(jìn)一步磺化制得，因此其可能的雜質(zhì)主要有兩個(gè)來源，一是作為磺化原料的參酮iia中沒有純化干凈的其他丹參酮類化合物，一是磺化過程中丹參酮iia其他殘留丹參酮磺化產(chǎn)物及其副產(chǎn)物，在對(duì)丹參酮iia磺酸鈉的藥理作用，藥物代謝動(dòng)力學(xué)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的制備工藝等進(jìn)行綜合考察的基礎(chǔ)上本課題采用色譜及波譜方法對(duì)丹參酮iia磺酸鈉進(jìn)行微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定1,2。 第一章文獻(xiàn)綜述1.1 丹參形態(tài)丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(salvia miltiorrhiza bge)的干燥根及根莖。該屬植物約900-1100種，主要分布于熱帶或溫帶。我國(guó)有約84種，分布于全國(guó)各地，尤以西南為多。除了丹參外，三

11、葉鼠尾草，云南鼠尾草的根也可以作為丹參入藥。其植物學(xué)性狀和產(chǎn)地如下6,7（見圖1）：圖1 多年生直立草本；根肥厚，肉質(zhì)，外面朱紅色，內(nèi)面白色，長(zhǎng)5-15厘米，直徑4-14毫米，疏生支根。莖直立，高40-80厘米，四棱形，具槽，密被長(zhǎng)柔毛，多分枝。葉常為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，葉柄長(zhǎng)1.3-7.5厘米，密被向下長(zhǎng)柔毛，小葉3-5，長(zhǎng)1.5-8厘米，寬1-4厘米，卵圓形成橢圓狀卵圓形或?qū)捙樞?，先端銳尖或漸尖，基部圓形成偏斜，邊緣具圓齒，草質(zhì)，兩面被疏柔毛，下面較密，小葉柄長(zhǎng)2-14毫米，與葉軸密被長(zhǎng)柔毛。輪傘花序6花或多花，下部者疏離，上部者密集，組成長(zhǎng)4.5-17厘米縣長(zhǎng)梗的頂生或腋生總狀花序；苞片技針

12、形，先端漸尖，基部楔形，全緣，上面無毛，下面略被疏柔毛，比花梗長(zhǎng)或短；花梗長(zhǎng)34毫米，花序軸密被長(zhǎng)柔毛或具腺長(zhǎng)柔毛?；ㄝ噻娦?，帶紫色，長(zhǎng)約1.1厘米，花后稍增大。外面被疏長(zhǎng)柔毛及具腺長(zhǎng)柔毛，具緣毛，內(nèi)面中部密被白色長(zhǎng)硬毛，具11脈，二唇形，上唇全緣，三角形，長(zhǎng)約4毫米寬約8毫米，先端具3個(gè)小尖頭，側(cè)脈外緣具狹翅，下辱與上唇近等長(zhǎng)，深裂成2齒，齒三角形，先端漸尖。花冠紫藍(lán)色，長(zhǎng)2-2.7厘米，外被具腺短柔毛，尤以上唇為密，內(nèi)面離冠筒基部約2-3毫米有斜生不完全小疏柔毛毛環(huán)，冠筒外伸，比冠檐短，基部寬2毫米，向上漸寬，至喉部寬達(dá)8毫米，冠檐二唇形，上唇長(zhǎng)12-15毫米，鐮刀伏，向上豎立，先端微缺，

13、下唇短于上唇，3裂，中裂片長(zhǎng)5毫米，寬達(dá)10毫米，先端二裂，裂片頂端具不整齊的尖齒，側(cè)裂片短，頂端圓形，寬約3毫米。能育雄蕊2，伸至上唇片，花絲長(zhǎng)3.5-4毫米，藥隔長(zhǎng)1720毫米，中部關(guān)節(jié)處略被小疏柔毛，上臂十分伸長(zhǎng)，長(zhǎng)14-17毫米，下臂短而增粗，藥室不育，頂端聯(lián)合。退化雄蕊線形，長(zhǎng)約4毫米。花柱遠(yuǎn)外伸，長(zhǎng)達(dá)40毫米，先端不相等2裂，后裂片極短，前裂片線形。花盤前方稍膨大。小堅(jiān)果黑色，橢圓形，長(zhǎng)約3.2厘米，直徑1.5毫米。花期4-8月，花后見果。產(chǎn)河北，山西，陜西，山東，河南，江蘇，浙江，安徽，江西及湖南；生于山坡、林下草叢或溪谷旁，海拔120-1300米。日本也有6,7。1.2丹參的化

14、學(xué)成分及其藥理作用丹參為唇形科植物丹參(salviae miltiorrhizaebge.)的干燥根及根莖。性微寒, 味苦, 是臨床最常用中藥之一。具有祛瘀止疼、活血調(diào)經(jīng)、清心除煩的功效、是活血化瘀的常用中藥。丹參的主要有效成分為脂溶性的二帖類化合物和水溶性酚酸類化合物。其中的丹參酮i、ii，異丹參酮i、ii，異丹參酮、丹參酸甲醋、丹參新酮、丹參酚、原兒茶醛、原兒茶酸等都具有藥學(xué)活性。由于丹參的上述各種療效均與丹參酮iia直接相關(guān)，且丹參酮iia標(biāo)準(zhǔn)品較易得到，其色譜行為與其它成分差距較大，以及丹參酮iia具有廣泛藥理作用，因此作為脂溶性成分的代表，并被中華人民共和國(guó)藥典用作為丹參藥材的質(zhì)量控

15、制指標(biāo)1。丹參廣泛用于治療心血管疾病的中藥復(fù)中，以丹參為主要的中藥制劑開發(fā)也相當(dāng)活躍14【丹參酮】（tanshinone）具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗血栓形成和抗炎等，常在中醫(yī)中被用來治療炎性疾病。丹參酮iia（tanshinone iia）在丹參中含量最多，丹參酮iia磺酸鈉（sodium tanshinone iia sulphonate, sts）是丹參酮iia的衍生物?！镜⑼猧ia】( tanshinoneiia)是從傳統(tǒng)的活血化淤類中藥丹參( salvia miltiorrhiza bge)中提取的脂溶性有效成分,易溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑, 微溶于水, 分子式為c h o

16、 , 分子量294.33,室溫下外觀性狀為紅褐色粉末或紅色結(jié)晶。丹參酮幾乎不溶于水，口服吸收差,生物利用度低,一般應(yīng)通過注射給藥。在空氣中丹參酮a迅速降解,而ph和復(fù)方成分則對(duì)該成分降解影響不大。丹參有效成分可分為脂溶性的丹參酮類(主要成分為1)及水溶性的丹參酸類(包括丹參素、原兒茶醛等) 35。有效成分具有抗心肌缺血、抗菌、抗雄性激素作用,水溶性成分具有抗心肌缺血和增加冠狀動(dòng)脈血流量等生物活性4。故中國(guó)藥典2000年版中將丹參的提取工藝定為醇提和水提結(jié)合的工藝路線。不少生產(chǎn)廠家雖按藥典工藝生產(chǎn),但產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果往往仍不合格。為此,本文從原料、提取工藝以等方面對(duì)丹參酮iia磺酸鈉質(zhì)量問題進(jìn)行研究

17、9。上世紀(jì)60年代kakisswa確定了丹參酮iia的結(jié)構(gòu)式；隨后，baidlie等人合成了丹參酮iia。由于丹參酮iia腸道吸收差， 臨床起效慢，故植物化學(xué)家錢明坤等人半合成了丹參酮iia磺酸鈉，并由上海制藥一廠、中藥三廠等制備成注射液制劑，用于心腦血管疾病的治療和預(yù)防。注射液推向市場(chǎng)其確切的療效得到廣大醫(yī)患的歡迎?！镜⑼猧ia磺酸鈉】( sodium tanshinone iia sulfonate , sts)是從丹參中分離出二萜醌類化合物丹參酮后經(jīng)磺化得到的水溶性物質(zhì)?；瘜W(xué)成份主要有隱丹參酮,丹參酮a( tanshinone iia) ,羥基丹參酮iia,丹參酮甲脂,異隱丹參酮以及丹

18、參新酮等。適用于冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病。8 ,91.3丹參酮iia磺酸鈉藥理作用的研究現(xiàn)狀:1.3.1 丹參酮iia 磺酸鈉對(duì)心血管系統(tǒng)的影響對(duì)心肌的影響藥理實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)麻醉狗一次靜脈推注sts 20 mg/kg后，血壓升高，心輸出量和左心室做功量稍有增加，心率和外周血管阻力的變化不顯著。王志敏等進(jìn)一步報(bào)道sts增加在位大鼠心臟的收縮幅度與上面的結(jié)果一致，并對(duì)sts對(duì)心肌和溶血的作用進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)離體豚鼠心臟灌流中，sts 0.5 - 20g/ ml灌流20 min，隨濃度而加重抑制心臟收縮幅度。麻醉大白鼠靜脈注射40 mg/kg能輕度增加在位心臟收縮幅度，0.1 mg/ ml對(duì)離體兔

19、左心室乳頭肌在缺氧條件下，電刺激收縮幅度下降一半所需要的時(shí)間延長(zhǎng)。0.02 或0.1 mg/ ml使兔紅細(xì)胞在低滲條件下的破裂減小，又減少牛血清白蛋白凝固。25 - 75g/ ml對(duì)離體豚鼠左心室乳頭肌膜電位和動(dòng)作電位的振幅和時(shí)程無明顯影響。并進(jìn)一步推測(cè)藥物對(duì)離體心臟和在體心臟的影響不同，可能由于：在離體心臟灌流中，sts抑制心肌收縮是藥物直接長(zhǎng)時(shí)間作用于心肌，而體內(nèi)給藥中，藥物在給藥瞬間血濃度很高，但很快趨向下降；藥物在體內(nèi)受到代謝轉(zhuǎn)化；神經(jīng)系統(tǒng)的影響；豚鼠與大白鼠的種鼠差異。sts能輕度增加大鼠在位心臟收縮力。增加收縮力的藥物可能會(huì)增加心肌耗氧量。但這類藥物也可能通過降低左心室舒張末期壓和

20、心容積，即降低室壁張力和心臟體積而降低心肌耗氧量。又從sts對(duì)乳頭肌在缺氧條件下收縮力下降50所需要的時(shí)間延長(zhǎng)，表明藥物似乎可以減少心肌對(duì)氧的需求，有助于心絞痛緩解。接著，我國(guó)學(xué)者從分子水平進(jìn)一步對(duì)sts對(duì)心肌的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。通過豚鼠離體心臟langendorff灌流法，造成心肌鈣反常模型，給予不同濃度的sts作為心肌保護(hù)劑，觀察sts對(duì)心肌鈣反常的保護(hù)作用，并與已知的鈣拮劑異搏定比較，探討sts的鈣拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sts對(duì)心肌鈣反常損傷具有明顯的保護(hù)作用，抑制鈣內(nèi)流，減輕鈣反常過程中心肌組織鈣沉積和心肌損傷所致的蛋白酶釋放 （p 0.01），且該作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴關(guān)系

21、，且作用效果優(yōu)于異搏定。同時(shí)作者用電鏡進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)觀察，比較了正常對(duì)照組，鈣反常組，鈣反常加異搏定組，鈣反常加sts組。結(jié)果表明與正常對(duì)照組相比，鈣反常組出現(xiàn)典型損傷，肌原纖維極度收縮，i、a帶融合，z線扭曲、排列紊亂，形成許多同心收縮帶，線粒體明顯腫脹、基質(zhì)疏松。部分線粒體內(nèi)外膜及嵴斷裂；肌膜破裂，間盤嚴(yán)重分離。鈣反常組加sts 10mg/l、20mg/l的兩組心肌形態(tài)學(xué)改善不佳，加30 mg/l、40 mg/l的兩組心肌形態(tài)學(xué)明顯改善，尤以30mg/l組為佳，除線粒體輕度腫脹、糖原略減少外，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。2 mg/l異搏定組心肌形態(tài)學(xué)亦有改善，但不如sts 30mg/l、 40

22、mg/l兩組。進(jìn)一步證實(shí)sts系通過其鈣拮抗作用保護(hù)心肌免受鈣反常損傷。新制備的家兔心肌細(xì)胞線粒體，在體外條件研究了sts對(duì)家兔正常的和異丙基腎上腺素(isp)興奮的心肌線粒體攝取鈣活力的響。結(jié)果表明sts對(duì)線粒體的主動(dòng)攝取鈣的影響也是具有鈣通道阻滯劑樣的作用。并能減少或抑制isp所引起的心肌線粒體鈣超載，從而起到保護(hù)心肌線粒體和心肌細(xì)胞免遭上述病理原因引起的高鈣沖擊和細(xì)胞壞死的后果。這可能即是t治療冠心病心絞痛和胸悶及改善缺血性心電圖；抗心肌缺血和縮小梗塞范圍；降低缺血后的乳酸增加等藥理作用的共同生化基礎(chǔ)。通過分離的成年豚鼠心室肌單細(xì)胞在高鉀(25 mmol/l)溶液中部分除極化使鈉通道失活

23、，用細(xì)胞內(nèi)刺激誘發(fā)慢反應(yīng)動(dòng)作電位。20 mol/l的sts對(duì)這種慢反應(yīng)動(dòng)作電位有明顯的抑制作用。在1-20mol/l濃度范圍內(nèi)，sts對(duì)0.28 mol/l的異丙腎上腺素強(qiáng)化的慢反應(yīng)動(dòng)作電位有濃度依賴性抑制作用。而且，隨異丙腎上腺素濃度的增加(69-0.55 mol/l)抑制作用更加明顯，進(jìn)一步說明sts可能是一種鈣拮抗劑。通過甲狀腺粉在誘導(dǎo)大鼠甲亢過程中心肌微粒體na+，k+-atpase，ca2+-atpasemg2+-atpase活性變化，曾林等探討高甲狀腺激素水平作用下sts對(duì)大鼠心肌微粒體atpase活性的保護(hù)作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證實(shí)sts不干擾甲狀腺粉誘脈流量，供給了心肌充足的氧，保護(hù)

24、atpase活性，以糾正心肌細(xì)胞內(nèi)異常的鈣代謝，減少細(xì)胞內(nèi)ca2+超載，對(duì)心肌起到保護(hù)作用。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，研究sts對(duì)豬冠脈平滑肌katp和kca的作用，從分子水平闡明其擴(kuò)冠機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在內(nèi)面向外式膜片方式下，5 20mol/ l 的sts可明顯激活katp，表現(xiàn)為通道開放概率、膜片通道開放數(shù)目增加，而且sts也可明顯增加kca通道開放概率，表現(xiàn)出明顯激活作用，因此，sts對(duì)原代培養(yǎng)豬冠脈平滑肌上katp和kca均有直接激活作用，sts對(duì)這兩種通道是否有間接作用尚需進(jìn)一步證實(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步從分子水平證實(shí)sts 對(duì)原代培養(yǎng)豬冠脈平滑肌上katp和kca均有直接激活作用，這可能也是它們

25、舒張冠脈的重要機(jī)制之一，而且由此可推測(cè)，sts通過對(duì)katp、kca的鉀通道開放和鈣通道阻滯的協(xié)同或聯(lián)合作用，可明顯減少血管平滑肌上的自發(fā)電活動(dòng)，引起血管舒張，在心血管疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用在體家兔缺血預(yù)適應(yīng)（ischemia preconditioning，ipc）模型，隨機(jī)將家兔24 只分為心肌缺血組（ir）、缺血預(yù)適應(yīng)組（ipc）和sts聯(lián)合缺血預(yù)適應(yīng)組（ds-201+ipc），應(yīng)用心外膜單相動(dòng)作電位（map）探針記錄技術(shù)檢測(cè)缺血-再灌注過程中心肌復(fù)極50時(shí)（mapd50）及心律失常發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間；ttc染色測(cè)定梗死面積；he染色病理組織學(xué)觀察，研究sts對(duì)家兔缺血預(yù)適應(yīng)

26、心肌電生理參數(shù)的影響及保護(hù)作用。結(jié)果表明，與ir組相比，ipc組缺血5 min時(shí)的mapd50：迅速縮短（p 0.05），缺血20 min時(shí)的mapd50縮短明顯減?。╬ 0.05），復(fù)灌30 min后mapd50的過度延長(zhǎng)程度明顯減?。╬ 0.05）。同時(shí)，缺血再灌注中室性心律失常發(fā)生率明顯降低（p 0.05）。在ds - 201+ipc組，缺血5 min時(shí)未見mapd50迅速縮短（p 0.05），缺血20 min及復(fù)灌30 min后mapd50及缺血再灌注中室性心律失常發(fā)生率與ipc組無差異（p 0.05）。病理學(xué)檢測(cè)顯示，ipc組心肌梗死面積及組織損傷程度均明顯小于ir組3,4。ds-2

27、01+ipc組心肌梗死面積及組織損傷程度均小于ipc組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ds-201 聯(lián)合ipc取消了缺血早期ipc顯著縮短mapd50的效應(yīng)。但對(duì)ipc抗缺血再灌注心律失常作用無顯著影響；sts能增強(qiáng)ipc縮小心肌梗死面積和減輕組織損傷的作用。其機(jī)制可能是ipc能抑制心肌細(xì)胞線粒體atp酶，減少atp的水解，有效保存心肌細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備。sts能降低ir后線粒體脂質(zhì)過氧化物的含量，改善線粒體膜的流動(dòng)性。用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞sts對(duì)血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及p-jnk，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)sts能顯著降低血管緊張素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白含量、蛋白合成速率的增加，對(duì)p-jnk

28、表達(dá)具有劑量依賴性的抑制作用；同時(shí)上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶表達(dá)。據(jù)此推測(cè)，sts抗心肌肥厚機(jī)制與上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶，抑制p-jnk表達(dá)相關(guān)。下一步研究應(yīng)著重于sts對(duì)erk以及p35 信號(hào)通路的上下游分子的影響，進(jìn)一步闡明sts抗心肌肥厚的機(jī)制，為其在臨床用于心肌肥厚的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)11,13對(duì)心血管系統(tǒng)的影響、對(duì)腦血管和細(xì)胞的影響、對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響、抗菌作用目前對(duì)丹參酮iia 及其鈉鹽的藥理作用研究取得了一定成果，但很少有人報(bào)道其在心血管受體的藥理學(xué)方面和在體內(nèi)與其他藥物的相互作用方面的研究5。但是其雜質(zhì)一直很少有研究，丹參酮iia磺酸鈉原料及丹參酮iia磺

29、酸鈉注射液上市后，發(fā)現(xiàn)無論是原料還是水針劑在生產(chǎn)和銷售過程中都會(huì)由于儲(chǔ)存而出現(xiàn)酸性增強(qiáng)，含量降低的現(xiàn)象因?yàn)樵匈|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有對(duì)丹參酮iia磺酸鈉原料及丹參酮iia磺酸鈉制劑有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行有效監(jiān)控。經(jīng)hplc檢查，丹參酮iia磺酸鈉原料及制劑中均存在一未知雜質(zhì)成分高達(dá)7%-15%。目前，丹參酮iia磺酸鈉研究主要還是集中在其藥理活性的探討上，原料中的微量雜質(zhì)成分的研究還是空白。由于丹參酮iia磺酸鈉是丹參提取物經(jīng)過化進(jìn)一步磺化制得，因此其可能的雜質(zhì)主要有兩個(gè)來源，一是作為磺化原料的參酮iia中沒有純化干凈的其他丹參酮類化合物，一是磺化過程中丹參酮iia其他殘留丹參酮磺化產(chǎn)物及其副產(chǎn)物，基于此方面的考

30、慮，本課題采用色譜及波譜方法對(duì)丹參酮iia磺酸鈉的微量雜質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)鑒定。采用硅膠、大孔樹脂等柱層析方法對(duì)丹參酮iia磺酸鈉的微量雜質(zhì)進(jìn)行制備分離，運(yùn)用1h,13c，nmr等波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。我們準(zhǔn)備在這方面進(jìn)行初步的研究。進(jìn)一步制備大量高純度樣品作為雜質(zhì)含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒別及質(zhì)量控制的方法，并比較了不同條件下的分離效果，建立了一個(gè)簡(jiǎn)單的含量測(cè)定方法可以用來作為原料藥的和注射劑的質(zhì)量控制。 第二章原料藥中微量成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定2.1實(shí)驗(yàn)方法2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器agilent 1100 系列高效液相色譜儀shim-pack clc-ods-c18(150mn*6.0mn 5m)色譜柱vw

31、d型紫外檢測(cè)器hp chemstation 色譜工作站（美國(guó)惠普公司）jzh柱溫箱（天津金洲科學(xué)儀器有限公司）旋蒸蒸發(fā)儀2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）乙酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）氯仿（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）丙酮（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司 ）95%乙醇 硅膠h（200-300目）大孔樹脂2.1.3 原料藥中微量成分的分離準(zhǔn)確稱取原料藥粗品2g，置于100ml圓底燒瓶中加水約25ml，超聲使其充分溶解。然后置于回流裝置上溫度90回流四個(gè)小時(shí)，將樣品轉(zhuǎn)移到500ml楔形瓶?jī)?nèi)置旋蒸儀上蒸干，樣品用40乙醇溶解，抽濾。冷卻后上樣。(原料藥高效液相色譜見圖

32、1)圖1 原料藥粗品高效液相色譜圖原料藥上大孔樹脂吸附兩個(gè)小時(shí)后用40乙醇洗脫。用試管接餾分，流速不能過快。大孔樹脂收集所得餾分反相板檢識(shí)（展開劑50%甲醇），對(duì)照品用95%乙醇溶解。點(diǎn)板后合并相同餾分，置于100ml楔形瓶?jī)?nèi)于旋蒸儀上蒸干，然后用95%乙醇少量溶解，旋蒸蒸干（如果殘留物成大片狀且色澤不均勻可用95%乙醇再次溶解，然后蒸干）。取出殘留物轉(zhuǎn)入試劑瓶?jī)?nèi)，得dst-1粗品.待上硅膠柱。取dst-1粗品100mg。取硅膠20g，硅膠柱采用濕法裝柱,干法上樣。以氯仿：丙酮=1：1洗脫，氣泵加壓。用10ml試管收集餾分，tlc檢識(shí) 展開劑為氯仿：甲醇=8：2。合并餾分后，高效液相檢測(cè)，流動(dòng)

33、相：甲醇：2%醋酸水=60%：40%；柱溫35；流速：1ml/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm；檢測(cè)含量達(dá)到97%以上( 見圖2-1，2-2)。圖2-1 dst-1粗品高效液相色譜圖圖2-2 dst-1粗品高效液相色譜圖2. 2目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及結(jié)果討論：羥基丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)dst-1粗品上硅膠柱分離得到的樣品dst-1，進(jìn)行氫譜共振檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見圖。圖3-1dst-1樣品氫譜掃描圖圖3-2樣品氫譜掃描圖)2.2.1丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定1hnmr數(shù)據(jù)（500mhz，tms，dmso-d6，(ppm)）7.85(1h,d,j=8.4 hz)，7.56(1h,d,j=8

34、.1 hz)說明為芳環(huán)上的氫，2.33(3h，s)為甲基峰，且與雙鍵相連，1.29(6h，s)為兩個(gè)甲基峰，3.08(2h,t,j=6.1hz)，1.72(2h,m)，1.62(2h,m)為三個(gè)-ch2-，結(jié)構(gòu)片斷與丹參酮iia骨架結(jié)構(gòu)相似，與文獻(xiàn)報(bào)道的丹參酮iia磺酸鈉數(shù)據(jù)相比，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，且峰的裂分要清晰；與丹參酮iia相比，h 7.16(1h,d,j=1.1)峰消失，且2.33(3h，s)沒有被裂分，但其他的峰位與裂分基本相似，說明sts的母核結(jié)構(gòu)為丹參酮iia，且在16位磺化。（見表2.1）2.2.2羥基丹參酮iia磺酸鈉的結(jié)構(gòu)鑒定1h nmr數(shù)據(jù)h(ppm)：7.87(d,j

35、=8hz,1h)、7.85(d,j=8hz,1h)為兩相互偶合的芳環(huán)氫，2.48(s,3h)為甲基，與雙鍵相連，1.40(s,3h)為甲基，1.28(s,3h)為甲基，1.98(m,2h)為兩個(gè)次甲基上的氫，2.15(m,1h)，1.53（m,1h）為次甲基上的兩個(gè)氫，和化合物丹參酮iia磺酸鈉相比，少了一個(gè)次甲基，但多出兩個(gè)相互偶合，化學(xué)位移在5.38(d,j=2hz,1h)，4.59(d,j=2.5hz,1h)的氫，考慮到二者的化學(xué)位移，以及偶極溶劑dmso-d6與羥基形成氫鍵，可以初步推斷其可能為羥基與叔甲基相連的結(jié)構(gòu)片斷。再加上在2.15(m,j=13.35hz,1h) ,1.53(m,j=13.35hz,1h),可知這兩個(gè)氫是諧偶，由此可知，該羥基應(yīng)該連在1位。綜合以上數(shù)據(jù)確定目標(biāo)化合物為羥基丹參酮iia磺酸鈉。（