10動物染色體工程hxy

1、 真核細胞染色體的組成真核細胞染色體的組成 組蛋白：組蛋白：H1、H2A、H2B、 H3、H4； 非組蛋白：非組蛋白：HMG、DNA結合結合 蛋白蛋白 DNA：不重復序列；中度重復不重復序列；中度重復 序列；高度重復序列序列；高度重復序列 少量的少量的RNA； 從DNA到染色體的包裝壓縮 DNA鏈鏈 核小體核小體 螺線管螺線管 染色單體染色單體 超螺旋超螺旋 壓縮比例：壓縮比例：76405 = 8400 （1：7） （1：6） （1：40） （1：5） Gene Expression 染色體組染色體組 染色體組染色體組 染色體組型染色體組型 染色體倍性染色體倍性 體細胞中的一組非同源染色體，它

2、們在形態(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶著控體細胞中的一組非同源染色體，它們在形態(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶著控 制一種生物生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個制一種生物生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個 染色體組染色體組。 染色體組型染色體組型是指一個體細胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征。是指一個體細胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征。 染色體倍性染色體倍性是指細胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。是指細胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。 Human mitotic chromosomes and karyotype 染色體組用符號染色體組用符號“X”表示

3、表示 生物體的體細胞染色體數(shù)用生物體的體細胞染色體數(shù)用2n表示，無論是二倍表示，無論是二倍 體還是多倍體，體還是多倍體，2n只表示體細胞的染色體數(shù)，并不只表示體細胞的染色體數(shù)，并不 表示其倍性，如：表示其倍性，如： 玉米體細胞染色體數(shù)玉米體細胞染色體數(shù)2n=20， 普通小麥體細胞染色體數(shù)普通小麥體細胞染色體數(shù)2n=42， 要正確表示倍性應寫成：要正確表示倍性應寫成： 玉米玉米2n=2X=20， 普通小麥普通小麥2n=6X=42。 符號符號“n”和和“X”的區(qū)別與聯(lián)系的區(qū)別與聯(lián)系 9 生殖細胞的減數(shù)分裂生殖細胞的減數(shù)分裂 騾騾 子子 母馬和公驢的后代母馬和公驢的后代 10 11 為什么騾子不能繁

4、殖后代？為什么騾子不能繁殖后代？ 馬的染色體數(shù)是馬的染色體數(shù)是64條，驢的染色體數(shù)是條，驢的染色體數(shù)是62 條，馬的卵子染色體數(shù)是條，馬的卵子染色體數(shù)是32條，驢的精子條，驢的精子 染色體數(shù)是染色體數(shù)是31條，通過精卵結合發(fā)育成的條，通過精卵結合發(fā)育成的 新個體新個體騾子的染色體數(shù)是騾子的染色體數(shù)是63條。條。 騾子的染色體聯(lián)繪紊亂，因此騾子的生殖騾子的染色體聯(lián)繪紊亂，因此騾子的生殖 細胞不能分化發(fā)育成完整的個體。細胞不能分化發(fā)育成完整的個體。 12 騾子生育的概率極低騾子生育的概率極低 騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時，每條染騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時，每條染 色體都沒有相對應的同

5、源染色體進行配對，這樣色體都沒有相對應的同源染色體進行配對，這樣 每一條染色體分到哪個配子里是隨機的，在這些每一條染色體分到哪個配子里是隨機的，在這些 配子中，只有配子里的染色體完全來自于馬的，配子中，只有配子里的染色體完全來自于馬的， 或來自于驢的，這樣的配子才有生育能力?；騺碜杂隗H的，這樣的配子才有生育能力。 13 獅虎獸（獅虎獸（liger） 雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。 獅虎獸的體型比獅或虎都要獅虎獸的體型比獅或虎都要 大，又同時具備兩者之間的大，又同時具備兩者之間的 外貌特征；獅子與老虎相戀、外貌特征；獅子與老虎相戀、 懷孕的概率極低，即使在人懷孕的概率極低，

6、即使在人 工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受 孕的機會也僅為孕的機會也僅為1至至2。 幼獸由于先天不足等原因，幼獸由于先天不足等原因， 成活率僅為五十萬分之一左成活率僅為五十萬分之一左 右。據(jù)資料顯示，目前世界右。據(jù)資料顯示，目前世界 上存活的獅虎獸只有上存活的獅虎獸只有20只左只左 右。右。 14 獅虎獸（獅虎獸（liger） 15 獅虎獸 獅 虎 虎獅獸 16 動物染色體工程動物染色體工程 p染色體倍性改造染色體倍性改造 p染色體結構改造染色體結構改造 p人工染色體的利用人工染色體的利用 17 10.1 10.1 動物染色體倍性改造動物染色體倍性改造 定義：指有目的、有計劃地

7、增加或減少定義：指有目的、有計劃地增加或減少 一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造 動植物新品種的一項染色體工程技術。動植物新品種的一項染色體工程技術。 主要包括：主要包括： 多倍體育種多倍體育種 單倍體育種單倍體育種 18 動物的多倍體育種動物的多倍體育種 多倍體（多倍體（polyploidy）:是指體細胞中含有三個是指體細胞中含有三個 或三個以上染色體組的個體或三個以上染色體組的個體 多倍體產(chǎn)生機制：多倍體產(chǎn)生機制：通過卵細胞第二極體的保通過卵細胞第二極體的保 留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實現(xiàn)留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實現(xiàn) 19 動物的多倍體育種動物的

8、多倍體育種 1 1染色體加倍技術染色體加倍技術( (人工誘導人工誘導) ) （1 1）化學誘導法化學誘導法 秋水仙素秋水仙素 細胞松弛素細胞松弛素B B （2 2）物理學方法物理學方法 1 1）溫度休克法）溫度休克法 2 2）水靜壓法）水靜壓法 (3 (3）生物學方法生物學方法 20 1. 1.化學方法化學方法 A. A. 細胞松馳素細胞松馳素B(cytochalasin)B(cytochalasin)： 能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞質(zhì)分抑制細胞質(zhì)分 裂裂，使用最早、最廣泛，其誘導效果也最突出。，使用最早、最廣泛，其誘導效果也最突出。 B. B. 秋水仙

9、素秋水仙素(colchicine)(colchicine)：主要用于植物主要用于植物 阻止細胞分裂過程中的阻止細胞分裂過程中的紡綞體紡綞體的形成，可使染色的形成，可使染色 體正常復制而細胞不發(fā)生分裂，從而形成同源多體正常復制而細胞不發(fā)生分裂，從而形成同源多 倍體細胞。倍體細胞。 C. C. 其他：其他： N N2 2O O 特點：特點：化學藥物價格昂貴，有毒性化學藥物價格昂貴，有毒性 2.2.物理學方法物理學方法 溫度休克法溫度休克法 原理：原理：引起細胞內(nèi)酶構型的變化，不利于酶促反應的進行，引起細胞內(nèi)酶構型的變化，不利于酶促反應的進行， 導致細胞分裂時形成紡綞絲所需的導致細胞分裂時形成紡綞絲

10、所需的ATPATP供應受阻。抑制供應受阻。抑制 第二極體的釋放，誘導三倍體或四倍體第二極體的釋放，誘導三倍體或四倍體 方法：方法：冷休克法（冷休克法（0-50-5）和熱休克法（）和熱休克法（3030左右）左右） 特點：特點：操作簡單，成本低廉，對胚胎發(fā)育影響小，有利于操作簡單，成本低廉，對胚胎發(fā)育影響小，有利于 養(yǎng)殖場大規(guī)模生產(chǎn)使用養(yǎng)殖場大規(guī)模生產(chǎn)使用 適用：適用：冷水魚類應用熱休克法，溫水性魚類用冷休克效果冷水魚類應用熱休克法，溫水性魚類用冷休克效果 較好較好 關鍵：關鍵：成功阻止第二次成熟分裂和第二極體的排出成功阻止第二次成熟分裂和第二極體的排出 2. 2.物理學方法物理學方法 B B、水

11、靜壓法、水靜壓法 原理：原理：抑制第二極體的排出或第一次卵裂抑制第二極體的排出或第一次卵裂 方法：方法：65kg/cm65kg/cm2 2 特點：特點：誘導率高（誘導率高（9090以上），處理時間短，對受以上），處理時間短，對受 精卵損傷小，成活率高。精卵損傷小，成活率高。 需要專門的設備需要專門的設備水壓機，成本較高，不水壓機，成本較高，不 適于大規(guī)模生產(chǎn)。適于大規(guī)模生產(chǎn)。 3. 3. 生物學方法生物學方法 動物通過雜交方法動物通過雜交方法 尤其是種間雜交獲尤其是種間雜交獲 得異源多倍體。得異源多倍體。種種 間雜交導致第二極間雜交導致第二極 體不排出。體不排出。 草魚草魚 三角魴三角魴 (2

12、n=48) ( 2n =48)(2n=48) ( 2n =48) 草魴雜種草魴雜種 (3n=72)(3n=72) 人工誘導三倍體的方法人工誘導三倍體的方法 p直接途徑，直接途徑，即用物理或化學的方法對受精卵即用物理或化學的方法對受精卵 進行處理，阻礙第二極體外排。（即前述的進行處理，阻礙第二極體外排。（即前述的 物理法、化學法）物理法、化學法） p間接途徑，間接途徑，即首先誘導獲得四倍體，待四倍即首先誘導獲得四倍體，待四倍 體個體性成熟后再與二倍體個體交配，從而體個體性成熟后再與二倍體個體交配，從而 獲得三倍體子代。獲得三倍體子代。 25 三倍體三倍體 植物植物 26 27 三倍體三倍體 動物

13、動物 2多倍體的倍性鑒定多倍體的倍性鑒定 （1）直接法）直接法 1）染色體計數(shù)：）染色體計數(shù)：是鑒定多倍體的一個準確的直接方法，是鑒定多倍體的一個準確的直接方法， 但比較費時。但比較費時。 2）DNA含量測定含量測定：細胞：細胞DNA含量測定是倍性鑒定的另含量測定是倍性鑒定的另 一個有效的直接方法。一個有效的直接方法。 （2）間接法）間接法 1）核體積測量）核體積測量 2）蛋白質(zhì)電泳）蛋白質(zhì)電泳 3）生化分析）生化分析 29 30 3動物多倍體育種的意義動物多倍體育種的意義 1 1）多數(shù)具有良好的生長率）多數(shù)具有良好的生長率 2 2）低等動物的種間雜交優(yōu)勢非常明顯）低等動物的種間雜交優(yōu)勢非常明

14、顯 3 3）巨大性）巨大性 4 4）育性低）育性低( (四倍體可育四倍體可育) ) 31 魚類三倍體育種的意義魚類三倍體育種的意義 p三倍體是非偶數(shù)染色體組，阻礙了生殖細胞正三倍體是非偶數(shù)染色體組，阻礙了生殖細胞正 常的減數(shù)分裂，結果導致性腺不能發(fā)育。不育常的減數(shù)分裂，結果導致性腺不能發(fā)育。不育 的三倍體經(jīng)濟魚類因為沒有性成熟階段性腺發(fā)的三倍體經(jīng)濟魚類因為沒有性成熟階段性腺發(fā) 育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點：育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點： 避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚肉質(zhì)量下降避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚肉質(zhì)量下降 并延長了上市時間并延長了上市時間 避免了性腺發(fā)育階段的生長停滯和死亡率增加避

15、免了性腺發(fā)育階段的生長停滯和死亡率增加 縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大 型個體型個體 32 利用三倍體魚類不育性的優(yōu)點，利用三倍體魚類不育性的優(yōu)點， 人們可以達到這樣的目的：人們可以達到這樣的目的： 獲得生長速度較快的三倍體品種，提高魚獲得生長速度較快的三倍體品種，提高魚 類養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益類養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益 控制養(yǎng)殖魚類的過度繁殖和防止對天然資控制養(yǎng)殖魚類的過度繁殖和防止對天然資 源的干擾源的干擾 33 湘云鯽湘云鯽由湖南師由湖南師 范大學生命科學學范大學生命科學學 院劉筠院士培育院劉筠院士培育 34 35 Triploid Grass Carp

16、三倍體草魚三倍體草魚 36 動物的單倍體育種動物的單倍體育種 1人工單性生殖人工單性生殖 （1）雌核發(fā)育）雌核發(fā)育gynogenesis dindenisis （2）雄核發(fā)育）雄核發(fā)育androgenesis ndrdenisis 37 動物的單倍體育種動物的單倍體育種 1.1.雌核發(fā)育雌核發(fā)育：指精子雖然能正常地鉆入卵子中并指精子雖然能正常地鉆入卵子中并 激活卵子，但精子的細胞核并未參與卵球的發(fā)育，激活卵子，但精子的細胞核并未參與卵球的發(fā)育， 胚胎的發(fā)育僅在胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳物質(zhì)母體遺傳物質(zhì)的控制下進行。的控制下進行。 方法：方法：經(jīng)遺傳失活的動物精子刺激而使卵子發(fā)育經(jīng)遺傳失活的動物精子

17、刺激而使卵子發(fā)育 為正常的為正常的二倍體二倍體動物。動物。 38 抑制第二極體外排 抑制第一次卵裂精子遺傳物質(zhì)失活 39 Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs with UV-irradiated sperm (which cannot contribute genetically), and can survive a few days. Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment s

18、hortly after fertilization. 40 朱朱 洗洗 細胞學家。浙江臨海人。細胞學家。浙江臨海人。19311931年獲法國國家博士學年獲法國國家博士學 位。中國科學院實驗生物研究所所長。長期從事兩位。中國科學院實驗生物研究所所長。長期從事兩 棲類、魚類、家蠶等動物卵子成熟、受精等研究棲類、魚類、家蠶等動物卵子成熟、受精等研究 。 19611961年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁 殖出殖出沒有外祖父的蟾蜍沒有外祖父的蟾蜍，證明了單性生殖的高等動，證明了單性生殖的高等動 物仍保有傳代的能力。物仍保有傳代的能力。 41 雌核發(fā)育的意

19、義雌核發(fā)育的意義 雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力雌核發(fā)育具有產(chǎn)生單性種群的能力 迅速地產(chǎn)生同源型二倍體克隆迅速地產(chǎn)生同源型二倍體克隆 可通過克隆自交，即以激素致使性逆轉(zhuǎn)可通過克隆自交，即以激素致使性逆轉(zhuǎn) 為雄性，再與同胞姐妹交配，獲得強壯的為雄性，再與同胞姐妹交配，獲得強壯的 純系同型配子二倍體，然后借助于雌核發(fā)純系同型配子二倍體，然后借助于雌核發(fā) 育，產(chǎn)生新的純系來篩選除去有害的等位育，產(chǎn)生新的純系來篩選除去有害的等位 基因，以改良近親繁殖系基因，以改良近親繁殖系 動物的單倍體育種動物的單倍體育種 2.2.雄核發(fā)育：雄核發(fā)育：用經(jīng)過紫外線、用經(jīng)過紫外線、X X線或線處理線或線處理 的卵子與正

20、常的精子受精，再在適當時間施的卵子與正常的精子受精，再在適當時間施 以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi)以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi) 的精子染色體加倍，而發(fā)育成完全為父本性的精子染色體加倍，而發(fā)育成完全為父本性 狀的二倍體。狀的二倍體。 定義：定義：遺傳失活的卵子與精子結合，發(fā)育成遺傳失活的卵子與精子結合，發(fā)育成 只有只有父本父本染色體個體的一種特殊生殖方式。染色體個體的一種特殊生殖方式。 43 人工誘導雌核發(fā)育的方法人工誘導雌核發(fā)育的方法 （1）精子遺傳物質(zhì)的失活）精子遺傳物質(zhì)的失活 輻射處理（輻射處理（紫外線紫外線）、）、 化學物質(zhì)、化學物質(zhì)、 直接去除受精卵中的雄性原核直接去

21、除受精卵中的雄性原核 （2）細胞分裂的阻止（雌核染色體二倍）細胞分裂的阻止（雌核染色體二倍 化）化） 溫度休克、靜水壓力、化學抑制劑處理溫度休克、靜水壓力、化學抑制劑處理 44 Heat-shock treatment to activated/fertilized eggs of Indian major carps to induce diploid gynogenesis/polyploidy respectively 熱休克 45 人工誘導雌核發(fā)育的方法人工誘導雌核發(fā)育的方法 （3）雌核發(fā)育的鑒別）雌核發(fā)育的鑒別 鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色、形狀鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色、形狀

22、 和生化等方面的指標為根據(jù)。和生化等方面的指標為根據(jù)。 目前，還采用細胞學和遺傳標記的方法目前，還采用細胞學和遺傳標記的方法 46 10.2 10.2 動物染色體結構的改造動物染色體結構的改造 染色體片段的刪除和重排染色體片段的刪除和重排 染色體的易位工程染色體的易位工程 47 染色體結構變異染色體結構變異 易位：一個染色體上某一 區(qū)段跟另一非同源染色 體上的區(qū)段發(fā)生互換 缺失：染色體的某一區(qū)段 及帶有的基因一起丟失 倒位：染色體上某一區(qū)段 連同它帶有的基因順序 發(fā)生180度倒轉(zhuǎn) 重復：一個染色體上增加 了相同的某個區(qū)段。 10.3 人工染色體人工染色體 人工染色體 酵母人工染色體 細菌人工染

23、色體 哺乳類人工染色體 人工染色體的應用 49 人工染色體人工染色體 染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自 我復制和向子細胞中平均分配，需要我復制和向子細胞中平均分配，需要3個關鍵序列：個關鍵序列： 1.自主復制自主復制DNA序列（序列（ARS） 是是DNA復制的起點，確保染色體能夠開始自我復制。復制的起點，確保染色體能夠開始自我復制。 2.著絲粒著絲粒DNA序列（序列（CEN） 確保染色體在細胞分裂時能平均分配到子細胞中。確保染色體在細胞分裂時能平均分配到子細胞中。 3.端粒端粒DNA序列（序列（TEL） 使使DNA能結束復制，確保

24、染色體的獨立性和穩(wěn)定性。能結束復制，確保染色體的獨立性和穩(wěn)定性。 50 人工染色體人工染色體 定義：定義：人工構建的含有人工構建的含有復制起始點、著絲粒復制起始點、著絲粒 和端粒和端粒三個關鍵序列的三個關鍵序列的載體載體系統(tǒng)。系統(tǒng)。 51 現(xiàn)正在研究的人工染色體有三種：現(xiàn)正在研究的人工染色體有三種： 酵母人工染色體（克隆容量酵母人工染色體（克隆容量105-1010bp） （yeast artificial chromosome, YAC） 細菌人工染色體（常用于克隆約細菌人工染色體（常用于克隆約300bp片段）片段） （bacterial artificial chromosome, BAC）

25、 哺乳類人工染色體哺乳類人工染色體 （mammalian artificial chromosome, MAC） 52 YAC YAC 載體基本序列元件載體基本序列元件： 酵母染色體DNA自主復制順序（ARS） ： 負責DNA復制 酵母染色體的著絲粒順序（CEN）： 保證酵母細胞分裂時染色體的分配 酵母染色體的端粒順序（TEL）： 維持染色體結構的穩(wěn)定性（兩端各 一個） 選擇標記：用于重組克隆的篩選 pYAC4是一個大腸桿菌穿梭質(zhì)粒， 含有Amp大腸桿菌篩選標記 YACYAC重組載重組載 體構建示體構建示 意圖意圖 完整的染色體DNA的提取 基因組DNA酶切大片段的獲取 YAC載體臂的制備 Y

26、AC臂與目的DNA大片段的連接 YAC重組體對酵母的轉(zhuǎn)化 YAC基因庫的鑒定 目的基因YAC克隆的篩選 目的基因YAC克隆的鑒定 YAC克隆技術流程克隆技術流程 YACYAC的主要用途是：的主要用途是： (1)YAC可容納大片段的外源DNA ，而且在構建基因組文構建基因組文 庫庫時需要較少的克隆。 (2)用YAC克隆構建的物理圖譜在復雜的生物基因組分析基因組分析 和和DNADNA測序測序中發(fā)揮著重要作用。目前，用YAC提供大片段 DNA構建染色體圖譜的技術已在人類、植物、昆蟲、鳥 類、兩棲類等動物中得到廣泛應用，相比于早期的DNA 片段載體，YAC是容納大片段外源DNA的首選載體。 (3)在基

27、因功能研究基因功能研究中，基因嵌入及轉(zhuǎn)基因技術都采用 了YAC克隆系統(tǒng)。通過YAC嵌入的基因不僅片段長，而且 嵌入的基因更適于體內(nèi)表達，并有利于基因保持其固有 的空間構象和功能的發(fā)揮。 YACYAC的缺點：的缺點： 1、插入片段大，穩(wěn)定性較差，不易操作 2、插入的大片段常發(fā)生缺失，使文庫不完整 3、YAC與酵母天然染色體分子結構相似分離 時難與天然染色體分開 4、文庫中的嵌合現(xiàn)象嚴重 5、因插入片段大，往往發(fā)生序列重排，造成 序列錯亂。 細菌人工染色體（細菌人工染色體（BAC） 新一代BAC載體為7.4kb的環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒，主要結 構有： F因子的因子的parA，parB，parC基因基因 保證低拷貝的BAC質(zhì)粒在大腸桿菌分裂時均勻分配到 子代細胞。 起始起始oriS基因基因 嚴密控制，決定低拷貝數(shù)和復制起始 解旋酶基因解旋酶基因repC 易于DNA復制和決定復制方向 選擇標志基因選擇標志基因Cmr 氯霉素抗性基因 lacZ基因基因 顏色鑒別重組子，外源基因插入其中 loxP和和cosN位點位點 易于克隆DNA回收和操作 BAC的特點： 宿主中只有1-2個拷貝 插入片段不易變化，穩(wěn)定遺傳 避免嵌合現(xiàn)象 轉(zhuǎn)化效率高 主要用于300b