細(xì)胞工程概述

1、Cell Engineering 一、細(xì)胞工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位一、細(xì)胞工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位 1. 1.生物技術(shù)生物技術(shù) 應(yīng)用生命科學(xué)及工程學(xué)的原理和技術(shù)，對生物進(jìn)行應(yīng)用生命科學(xué)及工程學(xué)的原理和技術(shù)，對生物進(jìn)行 控制和改造，以實(shí)現(xiàn)人類特殊需求的綜合性技術(shù)?？刂坪透脑欤詫?shí)現(xiàn)人類特殊需求的綜合性技術(shù)。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 基因工程基因工程 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 酶工程酶工程 發(fā)酵工程發(fā)酵工程 染色體工程染色體工程 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 2.2.生物技術(shù)的研究領(lǐng)域生物技術(shù)的研究領(lǐng)域 基因工程 在分子水平上，用人工方法提取、合成或重組不同生在分子水平上，用人工方法提取、合成或重組不同生

2、物的遺傳物質(zhì)，并通過載體把重組分子引入受體細(xì)胞，使物的遺傳物質(zhì)，并通過載體把重組分子引入受體細(xì)胞，使 其復(fù)制與表達(dá)其復(fù)制與表達(dá), ,最終實(shí)現(xiàn)商業(yè)價(jià)值的技術(shù)。最終實(shí)現(xiàn)商業(yè)價(jià)值的技術(shù)。 基因工程基本過程基因工程基本過程 轉(zhuǎn)化子篩選轉(zhuǎn)化子篩選 載體選擇載體選擇 目的基因提取目的基因提取 體外體外DNADNA重組重組 引入受體細(xì)胞引入受體細(xì)胞 重組重組DNADNA檢測檢測 蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程就是在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程就是在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識基礎(chǔ) 上，對蛋白質(zhì)進(jìn)行人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化上，對蛋白質(zhì)進(jìn)行人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化 產(chǎn)品的技術(shù)。產(chǎn)品的技術(shù)。 功能檢測功能檢

3、測 蛋白質(zhì)工程的基本過程蛋白質(zhì)工程的基本過程 分離純化目的蛋白分離純化目的蛋白 測定氨基酸序列測定氨基酸序列 分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 設(shè)計(jì)編碼該蛋白基因設(shè)計(jì)編碼該蛋白基因 分離、純化蛋白分離、純化蛋白 通過預(yù)先設(shè)計(jì)，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所通過預(yù)先設(shè)計(jì)，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所 需的酶，并采用各種方法使酶發(fā)揮最大催化功能，而需的酶，并采用各種方法使酶發(fā)揮最大催化功能，而 應(yīng)用于社會(huì)的一門技術(shù)。應(yīng)用于社會(huì)的一門技術(shù)。 酶工程酶工程 酶酶工程的基本過程工程的基本過程 分離純化分離純化 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測定酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測定 酶固化酶固化 酶的修飾與改造酶的修飾與改造 酶的生產(chǎn)酶的生產(chǎn) 發(fā)酵

4、工程 發(fā)酵工程的基本過程發(fā)酵工程的基本過程 菌種選育菌種選育 大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng) 活性產(chǎn)物誘導(dǎo)活性產(chǎn)物誘導(dǎo) 菌體及產(chǎn)物收獲菌體及產(chǎn)物收獲 染色體工程染色體工程 按照一定設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地削減、添加和替換同按照一定設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地削減、添加和替換同 源或異源染色體及某一部分，從而達(dá)到定向改變遺源或異源染色體及某一部分，從而達(dá)到定向改變遺 傳特性和選育新品種的技術(shù)。傳特性和選育新品種的技術(shù)。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 是在細(xì)胞水平上，采用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育是在細(xì)胞水平上，采用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育 生物學(xué)和分子生物學(xué)等理論方法，按人們需要生物學(xué)和分子生物學(xué)等理論方法，按人們需要 和設(shè)計(jì)改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳特性的綜合技術(shù)

5、。和設(shè)計(jì)改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳特性的綜合技術(shù)。 按照人們的設(shè)想，置換細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器。按照人們的設(shè)想，置換細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器。 細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程 二、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)二、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ) 三三、細(xì)胞工程的研究范圍細(xì)胞工程的研究范圍 微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程 植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程 動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程 轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞工程的主要技術(shù)細(xì)胞工程的主要技術(shù) 一、大規(guī)模細(xì)胞體外培養(yǎng)一、大規(guī)模細(xì)胞體外培養(yǎng) 二、細(xì)胞融合二、細(xì)胞融合 三、細(xì)胞核移植三、細(xì)胞核移植 四、基因轉(zhuǎn)移四、基因轉(zhuǎn)移 根據(jù)培養(yǎng)物的不同分為細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和根據(jù)培養(yǎng)物的不同分為細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和 器官

6、培養(yǎng)。器官培養(yǎng)。 一、大規(guī)模細(xì)胞體外培養(yǎng)一、大規(guī)模細(xì)胞體外培養(yǎng) 將活體中取出的組織或細(xì)胞，制成單個(gè)將活體中取出的組織或細(xì)胞，制成單個(gè) 細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液， 并培養(yǎng)于固體基質(zhì)或培養(yǎng)液中，使之生長和生存，并維并培養(yǎng)于固體基質(zhì)或培養(yǎng)液中，使之生長和生存，并維 持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 將一小片活體組織放在盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)器皿將一小片活體組織放在盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)器皿 中，使之貼壁生長過程。中，使之貼壁生長過程。 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)器官培養(yǎng) （二）細(xì)胞培養(yǎng)概述（二）細(xì)胞培養(yǎng)概述 1.體內(nèi)外細(xì)胞培養(yǎng)的差異和分化體內(nèi)外細(xì)胞培養(yǎng)的差異和分化 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞

7、形態(tài)，失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)， 分化特性減弱或不顯，分化特性減弱或不顯， 出現(xiàn)類似出現(xiàn)類似“反祖反祖” 現(xiàn)象；現(xiàn)象； 細(xì)胞趨單一化，或獲得永生及變成惡性細(xì)胞群。細(xì)胞趨單一化，或獲得永生及變成惡性細(xì)胞群。 體外體外 2.2.培養(yǎng)細(xì)胞分類培養(yǎng)細(xì)胞分類 粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。 （上皮細(xì)胞型和成纖維細(xì)胞型）（上皮細(xì)胞型和成纖維細(xì)胞型） 懸浮型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞： 不附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)不附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài) 下生長的細(xì)胞。下生長的細(xì)胞。 3.培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定性培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定性 血清血清

8、高血清高血清-成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 低血清低血清-上皮細(xì)胞樣上皮細(xì)胞樣 pH 太酸或太堿太酸或太堿-成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)-上皮細(xì)胞樣上皮細(xì)胞樣 細(xì)胞密度細(xì)胞密度 低密度低密度- 成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 高密度高密度- 上皮細(xì)胞樣上皮細(xì)胞樣 生長狀態(tài)生長狀態(tài) 貼附貼附-成纖維或上皮樣成纖維或上皮樣 懸浮懸浮- 圓形圓形 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 未轉(zhuǎn)化未轉(zhuǎn)化 - 成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化- 上皮細(xì)胞樣上皮細(xì)胞樣 Hela 3T3 （1）貼附）貼附 （2）接觸抑制）接觸抑制 （3）密度抑制）密度抑制 4.4.培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn) （1）培養(yǎng)細(xì)胞生命期）培養(yǎng)細(xì)胞生命期

9、指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間，包括原代包括原代 培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。 5.培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期:也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng) 到第一次傳代階段，一般持續(xù)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。周。 特點(diǎn)特點(diǎn): 細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。 與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。 傳代期傳代期:當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，由于當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密

10、度后，由于生存空間和營生存空間和營 養(yǎng)有限，必養(yǎng)有限，必需分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，需分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液， 以保持細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。以保持細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。 特點(diǎn)特點(diǎn): 在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺 盛，并能維持二倍體核型。盛，并能維持二倍體核型。 衰退期衰退期 特點(diǎn)特點(diǎn): 此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后 衰退凋亡。衰退凋亡。 （2 2）體外培養(yǎng)細(xì)胞生存期）體外培養(yǎng)細(xì)胞生存期 ( (潛伏期潛伏期; ;指數(shù)增生期指數(shù)增生期; ;停滯期停滯期) )

11、 細(xì)胞的細(xì)胞的“一代一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。 6.培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì) （1 1）糖）糖 （2 2）氨基酸）氨基酸 （3 3）維生素）維生素 （4 4）促生長因子）促生長因子 （5 5）其它物質(zhì)）其它物質(zhì) （三）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)原則（三）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)原則 使細(xì)胞的高密度和高濃度生長，以制備大量使細(xì)胞的高密度和高濃度生長，以制備大量 細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物的方法，培養(yǎng)容量常在細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物的方法，培養(yǎng)容量常在2L以上以上 。 1.增加培養(yǎng)容積增加培養(yǎng)容積 2.擴(kuò)大細(xì)胞附著面積擴(kuò)大細(xì)胞附著面積 3.抑制細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞凋

12、亡 3.抑制細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞凋亡 也稱細(xì)胞程序性死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由也稱細(xì)胞程序性死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由 基因控制的，細(xì)胞自主有序的死亡?；蚩刂频?，細(xì)胞自主有序的死亡。 凋亡小體凋亡小體 大小不等，有完整膜包裹的，內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及染色質(zhì)片段大小不等，有完整膜包裹的，內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及染色質(zhì)片段 的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu). 4.無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基 (1)(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (2)(2)生長因子和激素生長因子和激素 (3)(3)基質(zhì)基質(zhì) （四）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法（四）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法 1.懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng) 細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長和增殖細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)

13、生長和增殖 的培養(yǎng)方法。的培養(yǎng)方法。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 設(shè)備簡單，成本低。設(shè)備簡單，成本低。 容積可選擇性大。容積可選擇性大。 可連續(xù)收集培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物進(jìn)行分析、傳代。可連續(xù)收集培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物進(jìn)行分析、傳代。 無須消化，防止細(xì)胞損傷。無須消化，防止細(xì)胞損傷。 細(xì)胞濃度均一，產(chǎn)量恒定。細(xì)胞濃度均一，產(chǎn)量恒定。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 震蕩震蕩(避免沉降避免沉降)。 不斷充氣不斷充氣(細(xì)胞代謝和氣體交換細(xì)胞代謝和氣體交換)。 易產(chǎn)生氣泡易產(chǎn)生氣泡(添加抗泡沫劑添加抗泡沫劑)。 2.固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng) 是細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)。是細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)。 吸附法：使細(xì)胞在適當(dāng)條件下貼

14、附在載體表面、吸附法：使細(xì)胞在適當(dāng)條件下貼附在載體表面、 中空纖維膜或容器表面的技術(shù)。中空纖維膜或容器表面的技術(shù)。 包埋法：將細(xì)胞包埋于多聚物等海綿狀基質(zhì)中進(jìn)包埋法：將細(xì)胞包埋于多聚物等海綿狀基質(zhì)中進(jìn) 行培養(yǎng)的技術(shù)。行培養(yǎng)的技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長。細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長。 細(xì)胞生長密度較高。細(xì)胞生長密度較高。 培養(yǎng)液易于更換。易進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。培養(yǎng)液易于更換。易進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。 3.氣流驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)氣流驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng) 通過位于中心氣流管通過位于中心氣流管 底部的的噴射裝置將混合底部的的噴射裝置將混合 氣體注入容器，使培養(yǎng)物氣體注入容器，使培養(yǎng)物 在容器中循環(huán)流

15、動(dòng)培養(yǎng)的在容器中循環(huán)流動(dòng)培養(yǎng)的 技術(shù)。技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 簡化設(shè)計(jì)，降低成本簡化設(shè)計(jì)，降低成本. 以氣體為循環(huán)培養(yǎng)動(dòng)以氣體為循環(huán)培養(yǎng)動(dòng) 力，防止機(jī)械攪拌損傷力，防止機(jī)械攪拌損傷. 4.4.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 細(xì)胞吸附于微載體表面，并借助于攪拌器作用，細(xì)胞吸附于微載體表面，并借助于攪拌器作用， 均勻懸浮于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)均勻懸浮于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):擴(kuò)大細(xì)胞附著表面積擴(kuò)大細(xì)胞附著表面積 缺點(diǎn)缺點(diǎn):微載體之間的相互聚集微載體之間的相互聚集 (蛋白水解酶和適當(dāng)攪拌力蛋白水解酶和適當(dāng)攪拌力) 5.灌注培養(yǎng)系統(tǒng)灌注培養(yǎng)系統(tǒng) 將細(xì)胞培養(yǎng)在能以相同速率自動(dòng)替換培養(yǎng)液的容將細(xì)胞

16、培養(yǎng)在能以相同速率自動(dòng)替換培養(yǎng)液的容 器中的技術(shù)器中的技術(shù). . 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 可使細(xì)胞始終處于一個(gè)教可使細(xì)胞始終處于一個(gè)教 好的營養(yǎng)狀態(tài)和生存環(huán)境好的營養(yǎng)狀態(tài)和生存環(huán)境. 可連續(xù)收集培養(yǎng)細(xì)胞所分可連續(xù)收集培養(yǎng)細(xì)胞所分 泌的產(chǎn)物泌的產(chǎn)物. 可通過改變培養(yǎng)液的組成可通過改變培養(yǎng)液的組成 實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞狀態(tài)的人為調(diào)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞狀態(tài)的人為調(diào) 控控. 缺點(diǎn)缺點(diǎn): 設(shè)備復(fù)雜設(shè)備復(fù)雜,需大量培養(yǎng)基質(zhì)需大量培養(yǎng)基質(zhì),細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn),易污染易污染. 1)1)研究對象是活細(xì)胞研究對象是活細(xì)胞 2)2)研究條件可人為控制研究條件可人為控制 3)3)樣本可達(dá)到均一樣本可達(dá)到均一 4)4)便于觀察、檢測和記錄便于觀

17、察、檢測和記錄 5)5)研究范圍廣泛研究范圍廣泛 6)6)費(fèi)用經(jīng)濟(jì)費(fèi)用經(jīng)濟(jì) 1.1.細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) （五）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（五）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用 2.細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn) 3.細(xì)胞培養(yǎng)意義細(xì)胞培養(yǎng)意義 二、細(xì)胞融合二、細(xì)胞融合 也稱體細(xì)胞雜交也稱體細(xì)胞雜交,指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成 一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。（同核體，異核體）一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。（同核體，異核體） （二）（二）細(xì)胞融合的基本原理細(xì)胞融合的基本原理 基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性建立篩選基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性建立篩選 基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞建立篩選基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞建立篩選 由溫度敏感

18、型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞篩選 具有所需性狀的雜種細(xì)胞篩選具有所需性狀的雜種細(xì)胞篩選 u異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。 u同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。 u多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。 2.2.細(xì)胞融合類型細(xì)胞融合類型 根據(jù)融合細(xì)胞核的類型根據(jù)融合細(xì)胞核的類型: 3.3.融合因素融合因素 仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒 紫外線紫外線喪失感染活性（不感染細(xì)胞）喪失感染活性（不感染細(xì)胞） 保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合） 滅活的仙臺(tái)病毒滅活的

19、仙臺(tái)病毒 新城雞瘟病毒新城雞瘟病毒 皰疹病毒皰疹病毒 聚乙二醇聚乙二醇 4.4.細(xì)胞融合過程細(xì)胞融合過程 2 2）誘導(dǎo)融合：）誘導(dǎo)融合： 1 1）自然融合：）自然融合： ( (三三) )細(xì)胞融合方法細(xì)胞融合方法 生物法生物法: : 物理法物理法: : 化學(xué)法化學(xué)法: : 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :打破了細(xì)胞融合的種屬屏障。打破了細(xì)胞融合的種屬屏障。 缺點(diǎn)缺點(diǎn): : 病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病 毒的效價(jià)差異。毒的效價(jià)差異。 1.1.生物法生物法( (仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒法) ) 利用滅活病毒特性促進(jìn)細(xì)胞融合的方法利用滅活病毒特性促進(jìn)細(xì)胞融合的方法. 步驟：步驟： 兩細(xì)胞在病毒

20、黏結(jié)作用下兩細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下 彼此靠近；彼此靠近； 病毒作用細(xì)胞膜病毒作用細(xì)胞膜, ,使兩細(xì)胞使兩細(xì)胞 膜及胞質(zhì)互相滲透；膜及胞質(zhì)互相滲透； 兩細(xì)胞核互相融合，細(xì)胞兩細(xì)胞核互相融合，細(xì)胞 融為一體；融為一體； 細(xì)胞正常分裂成含有兩種細(xì)胞正常分裂成含有兩種 染色體的雜種細(xì)胞。染色體的雜種細(xì)胞。 2.2.物理法物理法 利用物理?xiàng)l件促進(jìn)細(xì)胞融合的方法利用物理?xiàng)l件促進(jìn)細(xì)胞融合的方法. 步步 驟驟 細(xì)胞膜接觸細(xì)胞膜接觸膜擊穿膜擊穿膜融合膜融合 電脈沖誘導(dǎo)電脈沖誘導(dǎo) 在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面電位發(fā)生改變，使異在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面電位發(fā)生改變，使異 種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂并連接

21、，直到閉和成完整的膜，種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂并連接，直到閉和成完整的膜， 形成融合體。形成融合體。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害小；融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害??； 裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察融合過程；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察融合過程； 誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。 2.2.物理法物理法 步步 驟驟 細(xì)胞膜接觸細(xì)胞膜接觸膜擊穿膜擊穿膜融合膜融合 3.化學(xué)法化學(xué)法 利用化學(xué)試劑促進(jìn)細(xì)胞融合的方法利用化學(xué)試劑促進(jìn)細(xì)胞融合的方法. 鹽類融合法鹽類融合法 高鈣和高高鈣和高pH值融合法值融合法 聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法(PEG法法) 聚乙二醇（聚

22、乙二醇（PEGPEG）法）法 PEG PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性 基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H H 鍵，從而在鍵，從而在 質(zhì)膜之間形成分子橋，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連和融合質(zhì)膜之間形成分子橋，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連和融合。另另 外，外，PEGPEG能增加脂膜的流動(dòng)性，使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)能增加脂膜的流動(dòng)性，使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā) 生融合成為可能。生融合成為可能。 機(jī)機(jī) 理理 分子量大于分子量大于 200 200 小于小于 6000 6000 者均可用作細(xì)胞融合劑者均可用作細(xì)胞融合劑, , 一般分子量低于

23、一般分子量低于10001000的的PEGPEG作融合劑最好。作融合劑最好。 u5050 PEGPEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。 uPEG PEG 溶液在溶液在 pH=6.0 pH=6.0 時(shí)細(xì)胞融合率最高。時(shí)細(xì)胞融合率最高。 條條 件件 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 易得，用法簡單，勿需特殊設(shè)備，融合成本低；易得，用法簡單，勿需特殊設(shè)備，融合成本低； 融合易控制融合易控制, ,效果穩(wěn)定效果穩(wěn)定, ,產(chǎn)生的異核率較高；產(chǎn)生的異核率較高； 融合過程不受物種限制。融合過程不受物種限制。 缺點(diǎn)缺點(diǎn): : 融合過程繁瑣，可能對細(xì)胞有毒害。融合過程繁瑣，可能對細(xì)胞有毒害。 特特 點(diǎn)點(diǎn) 步步 驟驟

24、細(xì)胞混合細(xì)胞混合 PEGPEG處理處理膜融合膜融合 研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系 揭示疾病發(fā)生的機(jī)制揭示疾病發(fā)生的機(jī)制 用于基因定位研究用于基因定位研究 用于動(dòng)植物育種和植物種質(zhì)保存用于動(dòng)植物育種和植物種質(zhì)保存 生產(chǎn)單克隆抗體、生物藥和疫苗生產(chǎn)單克隆抗體、生物藥和疫苗 用于細(xì)胞療法用于細(xì)胞療法 ( (四四) )細(xì)胞融合細(xì)胞融合的應(yīng)用的應(yīng)用 發(fā)酵工業(yè)優(yōu)良菌種改良發(fā)酵工業(yè)優(yōu)良菌種改良 人源單克隆抗體人源單克隆抗體 主要困難主要困難: （1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本。）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本。 （2）雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，且細(xì)胞不穩(wěn)定，易）雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，且細(xì)

25、胞不穩(wěn)定，易 喪失抗體分泌能力；喪失抗體分泌能力； （3） 獲得抗原特異的人獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難；淋巴細(xì)胞十分困難； （4）人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。）人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。 問題問題: : 1. 1.細(xì)胞株的遺傳性不穩(wěn)定細(xì)胞株的遺傳性不穩(wěn)定 2.2.存在倫理方面的問題存在倫理方面的問題 前景前景: : 1.1.有望對細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、腫瘤發(fā)生、有望對細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、腫瘤發(fā)生、 干細(xì)胞生物學(xué)等生命現(xiàn)象作出詮釋干細(xì)胞生物學(xué)等生命現(xiàn)象作出詮釋, , 2.2.可對癌癥及傳染病進(jìn)行有效的防護(hù)和治療?？蓪Π┌Y及傳染病進(jìn)行有效的防護(hù)和治療。 3.

26、3.有望克隆出人類胚胎有望克隆出人類胚胎, ,用于治療性克隆研究用于治療性克隆研究, , 4.4.可通過人類胚胎干細(xì)胞可通過人類胚胎干細(xì)胞, , 在體外誘導(dǎo)分化在體外誘導(dǎo)分化, ,克隆克隆 出人體組織和器官。出人體組織和器官。 ( (五五) )存在問題及醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景存在問題及醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景 利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)去利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)去 核細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，核細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換， 以以獲得重組細(xì)胞并發(fā)育成獲得重組細(xì)胞并發(fā)育成無性雜交新個(gè)體的技術(shù)。無性雜交新個(gè)體的技術(shù)。 三、細(xì)胞核移

27、植三、細(xì)胞核移植 ( (一一) )細(xì)胞細(xì)胞核移植核移植技術(shù)的建立技術(shù)的建立 (二二)核移植技術(shù)過程核移植技術(shù)過程 核受體細(xì)胞制備核受體細(xì)胞制備 核供體細(xì)胞制備核供體細(xì)胞制備 細(xì)胞核移植與激活細(xì)胞核移植與激活 重組細(xì)胞的培養(yǎng)重組細(xì)胞的培養(yǎng) 胚胎移入胚胎移入 1 1核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備 去核卵母細(xì)胞去核卵母細(xì)胞 激素刺激雌體超排卵激素刺激雌體超排卵 直接吸出濾泡卵丘直接吸出濾泡卵丘 在體外培養(yǎng)成熟在體外培養(yǎng)成熟 2核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 供體細(xì)胞來源供體細(xì)胞來源 胚胎卵裂球胚胎卵裂球 體細(xì)胞體細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞 3 3細(xì)胞核移植與激活細(xì)胞核移植與激活 胞質(zhì)內(nèi)注射（直接

28、）胞質(zhì)內(nèi)注射（直接） 方法方法 透明帶下注射（融合）透明帶下注射（融合） 重組細(xì)胞重組細(xì)胞移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)， 發(fā)育至桑椹胚或囊胚過程。發(fā)育至桑椹胚或囊胚過程。 羊、牛、豬羊、牛、豬體內(nèi)培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng) 大鼠、小鼠和兔大鼠、小鼠和兔體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 4 4重組細(xì)胞的培養(yǎng)重組細(xì)胞的培養(yǎng) 5 5胚胎移植胚胎移植 代孕母體代孕母體 外部特征明顯與供體品種不同外部特征明顯與供體品種不同 繁殖性能強(qiáng)繁殖性能強(qiáng) 體格稍大和健康品種體格稍大和健康品種 同期發(fā)情處理同期發(fā)情處理移入子宮移入子宮個(gè)體選擇個(gè)體選擇發(fā)育發(fā)育 (三三)核移植技術(shù)的應(yīng)用核移植技術(shù)的應(yīng)用 1 1制備轉(zhuǎn)基

29、因動(dòng)物；制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物； 2 2培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群 ； 3 3開展動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物；開展動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物； 4 4與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克?。慌c干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆； 5 5進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)；進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)； 6. 6. 研究生物學(xué)的基本問題研究生物學(xué)的基本問題 。 從轉(zhuǎn)基因羊的從轉(zhuǎn)基因羊的 羊奶中提取出治療羊奶中提取出治療 心臟病的藥物心臟病的藥物 tPAtPA 藥物生產(chǎn)藥物生產(chǎn) ( (一一) ) 基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移概述概述 將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞, ,并整合到受體細(xì)并整合到受體細(xì) 胞基因組中，使其遺傳性狀及

30、表型發(fā)生一定改變胞基因組中，使其遺傳性狀及表型發(fā)生一定改變 的技術(shù)。的技術(shù)。 四、基因轉(zhuǎn)移四、基因轉(zhuǎn)移 1.1.基因轉(zhuǎn)移概念基因轉(zhuǎn)移概念 外源目的基因制備外源目的基因制備 外源目的基因有效導(dǎo)入受體細(xì)胞外源目的基因有效導(dǎo)入受體細(xì)胞 篩選攜有目的基因細(xì)胞篩選攜有目的基因細(xì)胞 2.2.基因轉(zhuǎn)移過程基因轉(zhuǎn)移過程 采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取。采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取。 通過通過 mRNA 合成合成 cDNA。 人工合成人工合成 DNA 片段。片段。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段。）擴(kuò)增特定基因片段。 （1 1）目的基因選擇）目的基因選擇 3.3.基因轉(zhuǎn)移方法

31、基因轉(zhuǎn)移方法 （2 2）目的基因克?。┠康幕蚩寺?通過載體在宿主中克隆通過載體在宿主中克隆 選擇載體選擇載體 目的基因與載體連接目的基因與載體連接 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 通過通過 PCR反應(yīng)克隆反應(yīng)克隆 （3 3）目的基因轉(zhuǎn)移）目的基因轉(zhuǎn)移 u電穿孔法電穿孔法 u顯微注射法顯微注射法 u脂質(zhì)體包埋法脂質(zhì)體包埋法 u磷酸鈣介導(dǎo)磷酸鈣介導(dǎo)DNA共沉淀法共沉淀法 u病毒介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法 （二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 穩(wěn)定整合入基因組中的外源基因，能通過生穩(wěn)定整合入基因組中的外源基因，能通過生 殖細(xì)胞傳給后代，并發(fā)育成完整個(gè)體的動(dòng)物殖細(xì)胞傳給后代，并發(fā)育成完整個(gè)體的動(dòng)物. . 1

32、.1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念 選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定 篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 基因轉(zhuǎn)染的受精卵細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的受精卵細(xì)胞 2.2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過程 以以 RNA RNA 為遺傳物質(zhì)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成為遺傳物質(zhì)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成 DNA DNA 后嵌后嵌 入宿主基因組中，通過合成入宿主基因組中，通過合成 RNA RNA 及蛋白質(zhì)殼包裝而及蛋白質(zhì)殼包裝而 成的病毒。如成的病毒。如HIVHIV。 反轉(zhuǎn)錄病毒法反轉(zhuǎn)錄病毒法 反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒 顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞

33、法顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞法 1)1)基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染 1 1、球狀，直徑、球狀，直徑8080100nm100nm。 2 2、單股、正鏈、單股、正鏈 RNARNA：二倍體，：二倍體，7 711kb11kb，非傳染性核酸。，非傳染性核酸。 3 3、衣殼：、衣殼：2020面體對稱。面體對稱。 4 4、有囊膜：具有糖蛋白纖突、有囊膜：具有糖蛋白纖突( (約約7272個(gè)個(gè)) )。 5 5、具反轉(zhuǎn)錄酶，其在病毒感染細(xì)胞后即開始反轉(zhuǎn)錄。、具反轉(zhuǎn)錄酶，其在病毒感染細(xì)胞后即開始反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄病毒特性反轉(zhuǎn)錄病毒特性 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能有效地以單拷貝形式將目的基因整合入受體細(xì)胞基因組能有效地以單拷貝形式將目的基因整合入受體細(xì)胞基因組; 整合率高整合率高，且整合后目的基因能穩(wěn)定地遺傳且整合后目的基因能穩(wěn)定地遺傳; 整合機(jī)制明確，即在整合機(jī)制明確，即在TR區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞目的基因結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞目的基因結(jié)構(gòu). 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：目的基因載量小，一般只有目的基因載量小，一般只有8kb8kb，以免影響活性和穩(wěn)定。，以免影響活性和穩(wěn)定。 包裝過程易發(fā)生同源重組，形成野生型病毒，因此使用受限。包裝過程易發(fā)生同源重組，形成野生型病毒，因此使用受限。 病毒病毒 DNA DNA 可影響外源基因在宿主動(dòng)物的表達(dá)。可影響外源基因在宿主動(dòng)物的表達(dá)。