生物信息學(xué)講義蛋白質(zhì)組學(xué)(1)

1、 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 第一節(jié) 引言 第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析方法 第三節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲取與分析 蛋白質(zhì)組(proteome) 源于蛋白質(zhì)(protein)與 基因組(genome)兩個字的結(jié)合，意指“一種基因 組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至 一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)，是以細胞內(nèi)全部蛋 白質(zhì)的存在及其活動方式作為研究對象，注重研 究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有蛋白質(zhì)種類及 其與周圍環(huán)境（分子）的關(guān)系。 第一節(jié)第一節(jié) 引引 言言 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的策略蛋白質(zhì)組學(xué)研究的策略： 蛋白質(zhì)組學(xué)研究試圖比較細胞在不同生理或 病理條件下蛋白質(zhì)表達的異同，對相關(guān)蛋

2、白質(zhì)進 行分類和鑒定，并分析蛋白質(zhì)間的相互作用和功 能。 一種稱為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組 研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的 蛋白質(zhì)。 1.另一種策略稱為“功能法”，即研究不同時期細 胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的 差異表達，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目 標(biāo)。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍： 一種是“完全”蛋白質(zhì)組學(xué)或表達蛋白質(zhì)組學(xué) (expression proteomics)，主要分析構(gòu)成蛋白質(zhì)組 蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量，并以此來探討細胞、組織、 個體或特定狀態(tài)的特征。 另一種是“差異”蛋白質(zhì)組學(xué)或功能蛋白質(zhì)組 學(xué)，主要篩選和鑒定不同種類或狀態(tài)下

3、各樣品間蛋 白質(zhì)組的區(qū)別與變化，通過分析蛋白質(zhì)組中構(gòu)成蛋 白質(zhì)間相互作用及細胞內(nèi)功能單位，解析蛋白質(zhì)組 與細胞功能之間的相關(guān)性。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)（functional proteomics）” 研究細胞或個體在某一特定時間所表達或與某 個功能相關(guān)的蛋白質(zhì)集合體。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在細胞和生命有機體的整 體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可為食品改造、疫苗開發(fā)和 生物制藥等提供重要依據(jù)。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)已成為后基因組的重要組成部 分。 主要研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容： 蛋白質(zhì)組的組成成分，即蛋白質(zhì)組的表達模式 (exp

4、ression profile) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾 1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 一、 蛋白質(zhì)的指紋特征 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析方法蛋白質(zhì)分析方法 一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征 蛋白質(zhì)的指紋即肽質(zhì)量指紋譜具有特征性 由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)） 都不同，蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點的蛋白酶水 解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合 物質(zhì)量數(shù)亦具有特征性，稱為肽質(zhì)量指紋譜 （peptide mass fingerprinting，PMF），即蛋 白質(zhì)的指紋特征。 一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征 2. 肽質(zhì)量指紋譜

5、是鑒定蛋白質(zhì)的常用參數(shù) 質(zhì)譜指紋分析需要經(jīng)過蛋白質(zhì)原位酶解（包括 蛋白質(zhì)凝膠的脫色、還原和烷基化、酶解、萃取及 合并萃取液凍干后進行質(zhì)譜分析）、MALDI-TOF肽 質(zhì)量指紋圖測定（包括蛋白樣品脫鹽及制備、質(zhì)譜 儀進行肽質(zhì)量指紋圖測定）及蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫搜 尋等三個步驟。 一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征 3. 肽質(zhì)量指紋譜可用作其他測定參數(shù) 測定不同物種間的保留特性，從而推斷分子的功能。 由生物多樣性和進化上遠離引起的氨基酸殘基取代， 顯示了蛋白中的特征功能區(qū)。 在一個蛋白消解物中，用來檢測在化學(xué)或酶處理前 后的“非匹配”（即和預(yù)測片段不符）的肽，從而表 征蛋白的修飾。 二、蛋白質(zhì)的

6、定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)功能模式的研究是蛋白質(zhì)組研究的最終 目標(biāo)，其主要研究目標(biāo)是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的 相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)功能的關(guān)系。 蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)翻譯后修飾及蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用都是目前其研究的重要內(nèi)容。 蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位 1. 蛋白質(zhì)的定位基于十二類亞細胞結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位主要基于12類亞細胞的分 類數(shù)據(jù)庫（來自SwissProt）： 細胞膜、細胞質(zhì)基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶 體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、細胞骨架、 液泡、細胞核、細胞外基質(zhì)。 二、蛋白質(zhì)的定位、修

7、飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 2. 蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)合成后的轉(zhuǎn)運與定位有兩種機制 翻譯后轉(zhuǎn)運（post-translational translocation） 共翻譯轉(zhuǎn)運（co-translational translocation） 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位 3. 生物信息學(xué)預(yù)測亞細胞定位 構(gòu)建可靠的數(shù)據(jù)庫，對蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行 分析與預(yù)測，能加速蛋白質(zhì)亞細胞定位的研究。 l 綜合數(shù)據(jù)庫（SwissProt、MIPS等） l 模式生物數(shù)據(jù)庫 l 專門的亞細胞定位數(shù)據(jù)庫 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位 4.

8、蛋白質(zhì)信息的提取是亞細胞定位預(yù)測的基本步驟 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 l 蛋白質(zhì)分選信號 l 蛋白質(zhì)序列的氨基酸 組分 l 蛋白質(zhì)的功能域信息 l 序列比對信息 l GO注釋信息 l 氨基酸物理化學(xué)性質(zhì) l 混合性特征參數(shù) 蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位 蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），即是指蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯 后會在個別氨基酸鏈上共價結(jié)合各種非肽類基團，形 成翻譯后修飾。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾在體內(nèi)是一個動態(tài)的變化過程， 有效探明細胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)修飾譜的“翻譯后修飾 蛋白質(zhì)組學(xué)”成為當(dāng)今功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi) 容。

9、 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 1. 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)行使正常生理功能所 必需的 蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功 能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細，作用更為專一。 常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型：磷酸化、糖基化、 甲基化、泛素化、脂基化等。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 2. 質(zhì)譜是鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方法 蛋白質(zhì)翻譯后的修飾的解析主要采用電噴霧 （ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）兩種質(zhì) 譜技術(shù)。 質(zhì)譜主要通過

10、質(zhì)量偏移（mass shift）來識別翻 譯后修飾蛋白。 3. 基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定翻譯后修飾的結(jié)果分析采用數(shù)據(jù) 庫搜索法 由質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定翻譯后修飾肽段的主要方法分為兩 大類：數(shù)據(jù)庫搜索法（database searching）和從 頭測序法（DeNovo sequencing）。 常用的數(shù)據(jù)庫搜索法有SEQUEST、Mascot、 X!Tandem、MS-Align等。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 4. 生物信息學(xué)預(yù)測和鑒定方法有助于蛋白質(zhì)翻譯后 修飾的研究 生物信息方法的介入，能夠從序列和質(zhì)譜兩 個角度幫助大規(guī)模鑒定翻譯后修飾，有助于翻譯 后修飾蛋白

11、質(zhì)組學(xué)研究的迅速發(fā)展。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 5. 基于序列法是預(yù)測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要生物 信息學(xué)方法 同類翻譯后修飾位點周圍的片段往往都具有 很強的序列保守性，通過對常見翻譯后修飾的數(shù) 據(jù)的收集，及對發(fā)生同類修飾的蛋白序列特征的 研究如保守motif，從而能夠基于序列預(yù)測翻譯后 修飾。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾 1. 蛋白質(zhì)相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎(chǔ) 生命的基本過程就是不同功能蛋白質(zhì)在時空上有 序和協(xié)同作用的結(jié)果。 細胞各種重要的生理過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞 對外界環(huán)境及內(nèi)環(huán)境變化的

12、反應(yīng)等，都是以蛋白 之間相互作用為紐帶，并形成網(wǎng)絡(luò)。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 2. 蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相 互作用的基礎(chǔ) 典型蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域是一個具有結(jié)合專 一性的獨立折疊元件，可以插入新的蛋白質(zhì)中并 保留結(jié)合靶部位的能力。 它們的相互作用多是通過 2個多肽表面幾何構(gòu)型 和靜電力而相互連接。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 3. 實驗方法是鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用的 主要方法 酵母雙雜交系統(tǒng) 噬菌體表面展示技術(shù) 蛋白質(zhì)親和色譜 表面等離子共振技術(shù) 熒光共振能

13、量轉(zhuǎn)移技術(shù) 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 免疫共沉淀技術(shù) Pull-down技術(shù) 親和印跡 化學(xué)交聯(lián)技術(shù) 蛋白質(zhì)探針技術(shù) 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 4. 生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)相互作用研究的有力工具， 蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫是預(yù)測蛋白質(zhì)間相互作用 的基礎(chǔ) 使用最廣泛、數(shù)據(jù)信息最完善的人類相關(guān)的蛋白 質(zhì)相互作用公共數(shù)據(jù)庫有：BIND, DIP, IntAct, HPRD, MINT, MIPS 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白

14、質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 5. 預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的生物信息學(xué)算法 基于基因組信息的預(yù)測方法 基于進化信息的方法 基于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的從頭預(yù)測方法 需要三維結(jié)構(gòu)信息的方法 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 6. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是研究蛋白質(zhì)相互作 用的最終目標(biāo) 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以顯示蛋白質(zhì)從細胞表面到細胞核 的一系列變化過程，揭示參與該過程的一系列生 物學(xué)事件和作用因子，提示某一過程的中斷或變 化可能導(dǎo)致的生物學(xué)后果等。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 蛋白質(zhì)的分析通常是指對未知或已知蛋白質(zhì)結(jié)

15、構(gòu)及 功能的預(yù)測與解析。 對蛋白質(zhì)的分析基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的信息。 與蛋白質(zhì)分析有關(guān)的主要有蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列數(shù) 據(jù)庫、蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫等一次（級）數(shù) 據(jù)庫，及構(gòu)建而成的具有特殊生物學(xué)意義和專門用 途的蛋白質(zhì)二次（級）數(shù)據(jù)庫。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （一）蛋白質(zhì)物理特性的預(yù)測基于蛋白質(zhì)的一級 氨基酸序列 從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，可以預(yù)測出蛋白質(zhì)的許多物 理性質(zhì)，包括等電點、分子量、酶切特性、疏水 性、電荷分布等。 相關(guān)工具有：Compute pI/Mw，PeptideMass， TGREASE，SAPS等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫

16、（二）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以已知三維結(jié)構(gòu)和二級結(jié) 構(gòu)的蛋白質(zhì)為依據(jù) 二級結(jié)構(gòu)是指螺旋和折疊等規(guī)則的蛋白質(zhì)局部 結(jié)構(gòu)元件。不同的氨基酸殘基對于形成不同的二級 結(jié)構(gòu)元件具有不同的傾向性，這構(gòu)成了進行二級結(jié) 構(gòu)預(yù)測的基礎(chǔ)。 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測常用方法有：nnPredict， PredictProtein，SOPMA，COILS，TMpred， SignalP等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （三）蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測是最復(fù)雜和最困難的預(yù) 測技術(shù) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測最終是要從蛋白質(zhì)的氨基酸序列 預(yù)測出其三維空間結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)的折疊過程 仍然不十分明了，從理論上解決蛋白質(zhì)折疊的問 題仍較困

17、難。 有一定作用的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法最常見的是“同 源模建”和“Threading”方法。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （四）蛋白質(zhì)功能預(yù)測主要根據(jù)序列預(yù)測功能 思路及一般流程為： 通過相似序列的數(shù)據(jù)庫比對確定功能。 確定序列特性，如疏水性、跨膜螺旋和前導(dǎo)序列等。 通過序列模體數(shù)據(jù)庫等的比對確定功能，查未知序 列是否包含保守序列模體。 查對搜索Prosite等數(shù)據(jù)庫最終預(yù)測蛋白質(zhì)功能。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （五）蛋白質(zhì)分析有很多其他非在線軟件包工具 除了在線分析工具之外，尚有很多非在線的蛋白 質(zhì)分析軟件包工具得以開發(fā) 如：AnthePr

18、o ，PSAAM，VHMPT，MPEx等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （六）常用蛋白質(zhì)一次序列數(shù)據(jù)庫有PIR、 SwissProt、NRL-3D、TrEMBL、GenPept等 （七）蛋白質(zhì)二次序列數(shù)據(jù)庫是由一級序列數(shù)據(jù)庫 整合而來的復(fù)合數(shù)據(jù)庫 將一次數(shù)據(jù)庫整合起來構(gòu)建成復(fù)合數(shù)據(jù)庫或二次 數(shù)據(jù)庫，更有利于生物學(xué)家的使用。蛋白質(zhì)序列 二次數(shù)據(jù)庫主要有：Prosite，OWL，NRDB等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （八）蛋白質(zhì)一次結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫有PDB、SCOP、 CATH等 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫是生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 的主要組成部分，是隨X射

19、線晶體衍射分子結(jié)構(gòu) 測定技術(shù)的出現(xiàn)而出現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫，其基本內(nèi)容為 實驗測定的蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)原子坐標(biāo)。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （九）蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 如：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象參數(shù)數(shù)據(jù)庫 （DSSP）、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫（FSSP）、同源 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（HSSP） 等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲 取與分析取與分析 一、二維凝膠電泳分析技術(shù) 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) 四、酵母雙雜交系統(tǒng) 五、Rosentta Stone方法 六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 一、二維

20、凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù) 二維凝膠電泳 (two-dimensional electrophoresis，2-DE) 是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高、信息最多的技術(shù) （一）二維凝膠電泳技術(shù)的定義及特點 第一向是等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)，蛋 白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點。 第二向是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)， 蛋白質(zhì)進行分子量的分離。 固相pH梯度-SDS雙向凝膠電泳 (IPG-DALT電泳) 是目前最常用的2DE技術(shù)。 一、二維凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù) （二）IPG-DALT電泳是目前分辨率最高的電泳方法

21、 1. 樣品制備 2. 蛋白質(zhì)定量 3. 一向電泳 4. 一向膠條的平衡 5. 二向電泳 6. 凝膠檢測 一、二維凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù) 質(zhì)譜分析法是按照離子的質(zhì)荷比（m/z）大小對 離子進行分離和測定從而對樣品進行定性和定量 分析的一種方法。 自20世紀(jì)初產(chǎn)生起，質(zhì)譜已成為連接蛋白質(zhì)與基 因的重要技術(shù)，是蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也 最具活力和潛力的技術(shù) 。 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) （一）質(zhì)譜儀是質(zhì)譜分析技術(shù)的重要科學(xué)實驗儀器 質(zhì)譜儀(mass spectrometer, MS)是利用電磁學(xué)原理 使離子按照質(zhì)荷比進行分離，從而測定物質(zhì)的質(zhì)量 與含量的

22、科學(xué)實驗儀器，一般由進樣器、離子化源、 質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系 統(tǒng)組成，其中樣品入機的離子化源和測量被介入離 子分子量的質(zhì)量分析器是兩個關(guān)鍵的部件。 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) （二）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽分析中的應(yīng)用 1. 分子量測定 2. 肽譜測定 3. 肽序列測定 4. 巰基和二硫鍵定位 5. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) （三）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 （MALDI-TOF-MS）分析技術(shù) MALDI-TOF MS為脈沖式的離子化技術(shù)，從 固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測其分子量， 特點是對鹽和添加

23、物的耐受力高，樣品測量速度快， 且操作簡單。 l MALDI-TOF質(zhì)譜測定肽質(zhì)量指紋圖 l MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)用于蛋白質(zhì)C-端序列分析 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) （四 ）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）分析 ESI-MS采用連續(xù)離子化的方法，從液相中 產(chǎn)生離子，能快速、準(zhǔn)確地解決從小分子到生物 大分子或不穩(wěn)定有機分子質(zhì)量的測定問題，常作 為與其他分析技術(shù)聯(lián)用的首選儀器 。 l 電噴霧電離質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)和多其他子質(zhì)量 l 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法鑒定2DE蛋白質(zhì) 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù) （五）串

24、聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS） 串聯(lián)質(zhì)譜法可選擇性分析混合物中的某個組分而不 必將各組分分開。 第一級質(zhì)量分析器獲得所有組分的分子離子峰（母 離子），經(jīng)質(zhì)量過濾器挑出需進一步分析的母離子， 此母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)高流速惰性氣體碰撞誘導(dǎo)離 解（CID）產(chǎn)生碎片離子（子離子），子離子進入第 二級質(zhì)量分析器獲得母離子的碎片峰。 通過研究母離子和子離子的裂解關(guān)系，可以獲得多 肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。 （一）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量的、小型化的、 平行性的生物檢測技術(shù) 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) 為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中 除了酵母雙雜交、雙向電 泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等之外 的一種重要的工具。 （二）蛋白質(zhì)芯

25、片的基本原理與特點 蛋白質(zhì)芯片包括固定有保持天然活性的蛋白 質(zhì)、能與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA和RNA、糖類、 合成多肽及其他能夠從復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中特異 性地捕獲目的蛋白的小分子物質(zhì)的微陣列。 特點：特異性強、敏感性高、通量高、重復(fù) 性好、應(yīng)用性強、適用范圍廣。 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) （三）蛋白質(zhì)芯片的分類 1. 功能：功能研究型芯片和分析檢測型芯片。 2. 固定在芯片上的蛋白質(zhì)種類：抗體芯片和抗原芯片。 3. 芯片表面的化學(xué)成分：化學(xué)表面芯片和生物表面芯片。 4. 點樣蛋白質(zhì)有無活性功能：無活性和有活性芯片。 5. 載體：普通玻璃載體芯片、多孔凝膠覆蓋芯片、微孔 芯片

26、等。 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) （四）蛋白質(zhì)芯片的制備及分析 1. 被測物質(zhì)的準(zhǔn)備 2. 反應(yīng)過程 3. 芯片的檢測 4. 結(jié)果的分析 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) （五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)應(yīng)用廣泛 1. 基因表達的篩選 2. 特異性抗原抗體的檢測 3. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 4. 蛋白質(zhì)相互作用的研究 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)是一種 直接于酵母細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而 且靈敏度很高的分子生物學(xué)方法。 酵母雙雜交系統(tǒng)是鑒定及分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相 互作用的最常用及最有效的工

27、具之一，此技術(shù)現(xiàn) 已逐漸推廣到了如信號傳導(dǎo)、細胞周期調(diào)控及基 因表達調(diào)控等多個研究領(lǐng)域。 四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng) （一）酵母雙雜交系統(tǒng)原理 l 上游激活序列(UAS) l 氨基(N)端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD) l 羧基(C)端 的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD) l “誘餌”蛋白X l “獵物”蛋白Y 四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng) 人民衛(wèi)生出版社8年制及7年制臨床醫(yī)學(xué)等專業(yè)用生物信息學(xué) （二）酵母雙雜交系統(tǒng)特點與優(yōu)點 l 實現(xiàn)了真正的克隆基因目標(biāo)化 ； l 在細胞內(nèi)進行并完成的，反映了蛋白在體內(nèi)的 交互作用； l 可以高靈敏度地檢測蛋白與蛋白之間的交互作 用 。 四、酵母

28、雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng) （三）酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性及優(yōu)化 l 酵母細胞轉(zhuǎn)化效率低（酵母交配技術(shù)）； l 雜交過程在細胞核內(nèi)完成，不便于研究膜蛋白、 分泌蛋白、膜受體及胞質(zhì)蛋白（分離的泛素系 統(tǒng)）； l 結(jié)果假陽性、假陰性較高（雙篩選系統(tǒng)、三篩 選系統(tǒng)）。 四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng) Rosetta Stone方法即是近年來開發(fā)出的基 于基因組”上下文”的方法來預(yù)測蛋白質(zhì)相互 作用，用于研究非同源基因之間功能關(guān)朕的方 法。 五、五、Rosentta Stone方法方法 羅塞塔石碑(Rosetta Stone)是 1799年在埃及羅塞塔發(fā)掘出的刻有 古埃及文字及希臘文的石碑 。

29、三種文字相互對照，就可以知道 一個個古埃及象形文字所代表的含 義。 （一）Rosetta Stone方法的來源 羅塞塔石碑(Rosetta Stone)：石碑上用三種文字 書寫同一段話，對同一內(nèi)容文字進行互譯。 羅塞塔石碑方法(Rosetta Stone method)：又稱 為基因融合法(gene fusion method)。 五、五、Rosentta Stone方法方法 （二）Rosetta Stone方法的基本分析步驟 1. 建立一個輸入文件，里面包括待查蛋白質(zhì)序列； 2. 建立一個可供BLAST搜索的數(shù)據(jù)庫，并對序列數(shù) 據(jù)庫進行格式化； 3. 運行本地BLAST進行分析，并對BLAS

30、T出來的結(jié) 果進行分析； 4. 識別Rosetta Stone序列及預(yù)測蛋白間的功能關(guān)聯(lián)。 五、五、Rosentta Stone方法方法 （三）Rosetta Stone方法的應(yīng)用 l 潛力大：利用Rosetta Stone方法，在大腸桿菌中 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一共有6,809種潛在的蛋白質(zhì)間相互作 用，而在酵母中共有45,502種。 l 實驗驗證：有效的研究蛋白質(zhì)間相互作用的高通 量的實驗技術(shù) 。 五、五、Rosentta Stone方法方法 數(shù)據(jù)庫技術(shù)和相關(guān)的分析軟件, 是蛋白質(zhì)組 的研究不可缺少的信息學(xué)手段, 可用于這些數(shù)據(jù) 的存儲、管理與分析。 六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 （一）常用的蛋白質(zhì)組分析工具 1. 蛋白質(zhì)表達分布圖數(shù)據(jù)庫 2. 蛋白質(zhì)組圖譜自動識別