醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序一、目的確保人感染 H7N9 禽流感病毒核酸檢測(cè)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化、 規(guī) 化，降低人為不規(guī)操作對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響，保證結(jié)果的 準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。二、適用圍 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室按照關(guān)于醫(yī)院開展 人感染 H7N9 禽流感病毒核酸檢測(cè)有關(guān)工作的通知 （衛(wèi)辦 醫(yī)政函 2013 383 號(hào)）和關(guān)于做好醫(yī)療機(jī)構(gòu)人感染 H7N9 禽流感檢測(cè)試劑供給保障工作的通知（衛(wèi)發(fā)明電 2013 29 號(hào)）有關(guān)要求， 使用國(guó)家疾病預(yù)防控制中心制備或商品化 試劑盒開展人感染 H7N9 禽流感病毒核酸檢測(cè)工作。三、樣本采集、運(yùn)送和保存 盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本 （

2、上呼吸道樣本包 括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液 , 下呼吸 道樣本包括痰液、 氣管吸取物、 肺洗液、 肺組織等 ）。可將鼻、 咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率?；颊哂邢潞?吸道樣本時(shí)，應(yīng)優(yōu)先采集。根據(jù)試劑說(shuō)明書對(duì)樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采 集標(biāo)準(zhǔn)操作程序（ SOP ），并組織樣本采集人員進(jìn)行培訓(xùn)及 考核。樣本的采集應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照 SOP 進(jìn)行。樣本采集后，按照人間傳染病的病原微生物名錄中 高致病性禽流感病毒的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行包裝，用密封容器立即 送往實(shí)驗(yàn)室。若氣溫高時(shí)，需放入冰塊降溫。樣本抵達(dá)實(shí)驗(yàn) 室后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，24小時(shí)能檢測(cè)的樣本可置于 28 C 暫時(shí)保存，24

3、小時(shí)無(wú)法檢測(cè)的樣本則應(yīng)置于W -70 C狀態(tài)保 存。如無(wú)-70 C保存條件時(shí)，可于-20 C冰箱暫存。樣本避免 反復(fù)凍融。樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存不當(dāng)時(shí)，可因病毒 RNA 降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也可因?yàn)闃颖尽拔廴尽背霈F(xiàn)假陽(yáng)性結(jié) 果。四、PCR檢測(cè)（一）樣本處理 樣本的核酸提取應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進(jìn)行。按所采用的商品化試劑盒說(shuō)明書要求，取適量待檢樣本、陽(yáng)性及陰性對(duì)照 進(jìn)行核酸提取。樣本應(yīng)盡可能新鮮，提取過(guò)程應(yīng)嚴(yán)防RNA酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的 RNA 降解。提取過(guò)程如涉及離心 步驟，應(yīng)采用低溫冷凍離心機(jī)；在生物安全柜進(jìn)行加樣、提 取過(guò)程中，為防止 RNA 降解，可將試管架置于托盤平鋪的 碎冰上。提取好

4、的RNA應(yīng)及時(shí)用于檢測(cè)，否則應(yīng)當(dāng)-70 C保 存。如無(wú)-70 C保存條件，可于-20 C冰箱暫存。（二）試劑準(zhǔn)備 試劑準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進(jìn)行甲型流感病毒核酸、 禽流感 H7 亞型或 H7N9 病 毒核酸的檢測(cè)。試劑的配制按所用商品化試劑盒說(shuō)明書進(jìn) 行。除酶混合物外， 其它試劑在使用前應(yīng)當(dāng)在室溫充分復(fù)融， 混勻并瞬時(shí)低速離心。反應(yīng)液分裝時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上 機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免管溶液泄露污染儀 器。分裝有擴(kuò)增反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)當(dāng)扣蓋或裝入密實(shí)袋再轉(zhuǎn) 移至樣本處理區(qū)。（三）加樣 加樣應(yīng)當(dāng)在樣本處理區(qū)進(jìn)行。加樣時(shí)應(yīng)當(dāng)使樣品完全落 入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘

5、附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊 管蓋。按試劑、儀器說(shuō)明書完成加樣和 PCR 反應(yīng)管準(zhǔn)備。（四）PCR 擴(kuò)增檢測(cè)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。待檢 PCR 管轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增 區(qū)，按順序置于 PCR 儀上，編輯樣本信息， 按試劑和儀器說(shuō) 明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)。（五）結(jié)果分析根據(jù)所用試劑盒說(shuō)明書設(shè)置基線值（ baseline ）。熒光 閾值（ threshold ）設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)陰性對(duì)照品擴(kuò)增 曲線（無(wú)規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)為原則，且 Ct 值應(yīng)大于 所設(shè)置的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（或顯示為 undet ）。使用儀器配套軟 件自動(dòng)分析結(jié)果。六）質(zhì)量控制檢測(cè)過(guò)程對(duì)可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性和假陰性進(jìn)行質(zhì)量控制， 除了檢測(cè)商品試

6、劑盒所提供陽(yáng)性和陰性對(duì)照外，每次臨床樣 本檢測(cè)時(shí)，至少應(yīng)當(dāng)有 1 份弱陽(yáng)性和 3 份陰性質(zhì)控樣本（多 份陰性質(zhì)控樣本設(shè)置對(duì)實(shí)驗(yàn)室“污染”所致假陽(yáng)性的監(jiān)控更 為有效），隨機(jī)放在所檢測(cè)標(biāo)本的中間。弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本可 為檢測(cè)陽(yáng)性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病 毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“標(biāo)”控制假陰性， 或弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本來(lái)源困難，可暫不設(shè)弱陽(yáng)性質(zhì)控。陰性質(zhì) 控樣本采用標(biāo)本采集管溶液即可。質(zhì)控樣本應(yīng)與臨床標(biāo)本同 等對(duì)待，參與樣本核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)全過(guò)程。試劑盒中的陽(yáng)性和陰性對(duì)照用于判斷實(shí)驗(yàn)室的有效性， 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。（七）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定與解釋。 按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)于出現(xiàn)弱

7、陽(yáng)性結(jié)果的樣本應(yīng) 進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，并注意與可能的實(shí)驗(yàn)室輕度或樣本交叉“污 染”所致假陽(yáng)性結(jié)果區(qū)別。五、檢測(cè)結(jié)果報(bào)告按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。六、其它注意事項(xiàng)（一）人感染 H7N9 禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)、 樣本采集 和運(yùn)輸按照人間傳染的病原微生物名錄中高致病性禽流 感病毒進(jìn)行管理。從事人感染禽流感檢測(cè)的技術(shù)人員必須經(jīng) 過(guò)生物安全培訓(xùn)并具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，在檢測(cè)過(guò)程中必須 采取生物安全防護(hù)措施（使用眼罩、 N95 型口罩等）。樣本 核酸提取必須在口級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)年檢合格的二級(jí) 生物安全柜進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有良好的通風(fēng)。（二）注意儀器設(shè)備的日常和定期維護(hù)，加樣器、擴(kuò)增 儀和溫育設(shè)備應(yīng)進(jìn)行定期校準(zhǔn)。試

8、劑盒及一次性使用的無(wú) DNA 酶和 RNA 酶 PCR 反應(yīng)管、離心管、帶濾芯吸頭等應(yīng) 進(jìn)行每批質(zhì)檢。（三）實(shí)驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)物品、工作服等均應(yīng) 當(dāng)專區(qū)專用，不得交叉使用。實(shí)驗(yàn)后應(yīng)及時(shí)清潔工作臺(tái)，以 防污染。（四）每批實(shí)驗(yàn)室后，可采取實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)、 10% 次氯酸 鈉溶液擦洗地臺(tái)面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴(kuò)增 產(chǎn)物氣溶膠污染。（五）使用中國(guó)疾控中心制備試劑開展檢測(cè)工作時(shí)，可 參考相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書（見附件 1、 2）有關(guān)要求。附件：1. H7N9 亞型禽流感病毒 RNA 檢測(cè)試劑盒（熒 光 PCR 法）說(shuō)明書2. H7N9 禽流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒 （PCR- 熒光 探針?lè)ǎ┱f(shuō)明書H

9、7N9亞型禽流感病毒 RNA檢測(cè)試劑盒（熒光PCF法）說(shuō)明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱：H7N9亞型禽流感病毒 RNA檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）英文名稱：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA （ Fluorescence PCR ）【包裝規(guī)格】48人份/盒。【預(yù)期用途】本試劑用于對(duì)咽拭子樣本中H7N9 亞型禽流感病毒RNA進(jìn)行定性檢測(cè)，用于 H7N9禽流感病毒感染的輔助診 斷及流行病學(xué)監(jiān)控?！緳z驗(yàn)原理】 根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理，針對(duì) H7N9亞 型禽流感病毒的HA基因和 NA基因設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針，通過(guò)熒光 PCR檢測(cè)儀

10、進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H7N9亞型禽流感病毒 RNA的定性檢測(cè)。試劑盒以正常人上皮細(xì)胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（ RNase P ）的mRNA為正常人體細(xì)胞對(duì)照，對(duì)提取和檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。【主要組成成分】名稱成分規(guī)格數(shù)量（管）H7反應(yīng)液含標(biāo)RNP、H7亞型特異基因的引物探針混合液1.0ml/ 管1N9反應(yīng)液含標(biāo)RNP、N9亞型特異基因的引物探針混合液1.0ml/ 管1DNA聚合酶DNA聚合酶，不可用其他同類 DNA聚合酶替代60 卩 l 管1逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，不可用其他冋類逆轉(zhuǎn)錄酶替代60卩l(xiāng)管1陽(yáng)性對(duì)照RNP、H7、N9 RNA 假病毒混合物1.0ml/ 管1陰性對(duì)照DEPC 水1.0ml/ 管1本品各組成成分均不得與其他產(chǎn)品或不同批號(hào)產(chǎn)品中的相應(yīng)組成成分進(jìn)行互換。本品不包含，但對(duì)試驗(yàn)必須的設(shè)備和試劑：生物安全柜、臺(tái)式離心機(jī)、旋渦震蕩器、拭子、采樣管、 無(wú)菌病毒采樣液、1.5 ml無(wú)核酸酶的離心管、全自動(dòng)熒光 PC