多糖分離純化的基本原則和方法

1、多糖分離純化的基本原則和方法多聚糖(polysaccharide)，簡稱多糖，常由一百個以上甚至幾千個單糖基通過糖苷鍵連接而成的，其性質(zhì)已大不同于單糖，如甜味和強的還原性已經(jīng)消失，廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物的細胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，與生命功能的維持密切相關(guān)。近年來，大量研究表明多糖除了有增強免疫功能、抗腫瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系統(tǒng)保護作用的生物學(xué)效應(yīng)外，還有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗凝血等作用。1、基本原則 在不破壞多糖活性的前提下進行多糖的分離純化。盡量不引入新的雜質(zhì)，或引入的新雜志易于除去，如小分子鹽類可經(jīng)過透析作用除去，銨根離子可通過加熱揮發(fā)除

2、去等1。2、分離純化方法 多糖的生物活性倍受關(guān)注，但不少多糖的提取方法和工藝尚未成熟，基于效率、成本多方面的考慮，各種方法的開發(fā)、比較、分析是研究工作的焦點之一。目前多糖提取方法主要有溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲法、微波法、超臨界流體萃取法。首先要根據(jù)多糖的存在形式及提取部位不同，決定在提取之前是否做預(yù)處理：提取時需注意對一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在用水提取前，應(yīng)先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚進行脫脂，而對含色素較高的根、莖、葉、果實類，需進行脫色處理。2.1多糖的提取與分離方法 由于各類多糖的性質(zhì)及來源不同，所以提取方法也各有所異，主要歸納為

3、以下幾類： 第一類 難溶于水，可溶于稀堿液的主要是膠類，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液經(jīng)中和及濃縮等步驟，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二類 易溶于溫水，難溶于冷水的多糖，可用7080熱水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白質(zhì)，經(jīng)透析、濃縮后再加入乙醇即得粗多糖產(chǎn)物2。 第三類 粘多糖的提取。在組織中，粘多糖與蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合，故提取時需設(shè)法破壞粘多糖與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合鍵。通常使用蛋白酶水解蛋白部分或堿處理，使粘多糖與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合鍵斷裂，以促進粘多糖的釋放以便于提取3。（1）堿液提取法：本法的主要依據(jù)是蛋白聚糖的糖肽鍵對堿不穩(wěn)

4、定。原料經(jīng)預(yù)處理后用0.5mol/L NaOH溶液4提取，提取液用酸中和。蛋白質(zhì)可用調(diào)pH、加熱、或用白陶土吸附法除去。最后以乙醇沉淀即可獲得成品。從軟骨中提取軟骨素即用此法。（2）蛋白水解酶消化法：從組織中釋放出粘多糖的方法，經(jīng)常使用的是蛋白水解酶進行消化。一般應(yīng)用專一性低的蛋白酶如木瓜蛋白酶及鏈霉素以進行廣泛的蛋白質(zhì)水解。經(jīng)酶消化后的提取液中主要還有低分子量得蛋白消化產(chǎn)物及殘存蛋白等雜質(zhì)。蛋白質(zhì)可用5%三氯醋酸沉淀去除，小分子的雜質(zhì)可用透析法去除。最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。2.2多糖的除雜質(zhì) 蛋白質(zhì)的去除，通過水提所獲得的粗多糖常含有較多的蛋白質(zhì)。采用醇沉或其它溶劑沉淀得到的粗多糖中常含

5、有較多的蛋白質(zhì)，需要除蛋白。除蛋白的方法傳統(tǒng)上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。三氯乙酸法去除蛋白率高, 但多糖在三氯乙酸中不穩(wěn)定，糖苷鍵易斷裂，故多糖損失率也較高。鞣酸法蛋白去除率較低，但是此種方法是利用鞣酸與蛋白質(zhì)的特異性反應(yīng), 不會造成多糖的損失。Sevag 法蛋白去除率最高,但是由于此法使用的試劑是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物質(zhì),容易造成多糖活性下降和溶劑殘留。另外, 有機溶劑與去蛋白酶結(jié)合的除蛋白法也常被用在實驗研究中，其效率更高，更加節(jié)省試劑和資金。為了避免使用有機溶劑可采用反復(fù)凍融的方法除蛋白。 色素的去除，植物多糖提取物中含有酚類化合物,在多糖提取過程中由

6、于氧化作用會有色素生成，色素的存在會影響多糖的色譜分析和性質(zhì)測定。常用的脫色方法有：吸附法(DEAE纖維素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(過氧化氫)、離子交換法。 除小分子雜質(zhì)，小分子雜質(zhì)如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統(tǒng)的方法是透析法，該法操作簡單、技術(shù)成熟，但周期長，往往需要2 d-3 d，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術(shù)的發(fā)展，纖維濾器透析法已經(jīng)發(fā)展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產(chǎn)周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質(zhì)的一條新途徑。2.3多糖的純化方法 多糖的純化

7、方法很多，須根據(jù)條件適當(dāng)選擇。必要時可使用多種方法以達到理想的分離結(jié)果1.分級沉淀法用乙醇進行分級分離是分離多糖混合物的經(jīng)典方法，并且適用于大規(guī)模分離。該法往往需要多次重復(fù)進行才能達到較好的效果。如從肝素生產(chǎn)廢棄物中分離純化硫酸皮膚素4。分級沉淀有機試劑的篩選有機試劑沉淀法作為純化生物大分子物質(zhì)的一種經(jīng)典方法，選擇有機溶劑時應(yīng)能和水混溶，使用較多的有機溶劑如乙醇、丙醇、丙酮等，為避免生物活性大分子變性失活，沉淀應(yīng)在低溫下進行。分別選取乙醇、丙醇和丙酮作為沉淀劑，取預(yù)處理后的樣品按固液比110 溶解于去離子水中，加入0.1V 體積的沉淀劑，搖勻20min，4 密封靜置24h。離心12000r /

8、min，20min，4 ，取出沉淀并用20mL 去離子水沖洗、凍干。再向上清液中加入0.1V 原溶液體積的沉淀劑，重復(fù)上述操作，直至加入沉淀劑時連續(xù)5 次無沉淀產(chǎn)生。取各次沉淀溶解后進行醋酸纖維素薄膜電泳檢測。 2.季銨鹽絡(luò)合法粘多糖的聚陰離子與某些表面活性物質(zhì)，如十六烷基三甲基溴化銨中的季銨基陽離子結(jié)合生成季銨絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強度的水溶液中不溶解。當(dāng)離子強度增大時，這些絡(luò)合物可以解離并溶解。本法的優(yōu)點是既適用于實驗室又適用于生產(chǎn)。季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分離。當(dāng)溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高，也會與中性多糖形成沉淀。

9、常用的季銨溴化物(cetyltrimethyl ammonium bmmide，cTAB)及其氫氧化物(cetyl t methyl amm0nium hydr(Jxiode，CTA一0H)和(certylpyridium hydroxide，CP一0H)，其濃度一般為1 10 (WV)，它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級沉淀分離出酸性多糖。 3. 柱層析法 3.1凝膠柱層析法：常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，使各種多糖得以分離純化，但不適宜粘多糖的分離。 3.2離子交換層析常用的交換劑為DEAE-纖維素

10、、DEAE-葡萄糖凝膠(DEAESephadex)、DEAE-瓊脂糖凝膠(DEAE-Sepharose)，此法適用于分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。最常用的是DEAE-纖維素在pH為6時酸性多糖吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，然后用逐步提高鹽濃度的洗脫液進行洗脫進而達到分離。它一方面可純化多糖，另一方面還可分離各種多糖。如川芎多糖的分離純化5：纖維素柱水平衡后，取200mg粗多糖樣品溶解于蒸餾水中上樣，蒸餾水洗脫70ml后，以03mol/l NaCl溶液梯度洗脫，流速1.0ml/min，每管收集2ml，硫酸苯酚法顯色檢測。 凝膠柱層析和離子交換層析往往在分離純化過程中交替使用，以達到更好的分離

11、純化效果。如灰樹花多糖GFP75-2-2B6的分離： 4.超濾法采用中空纖維超濾膜，對多糖去蛋白質(zhì)后的提取液通過超濾去除小分子雜質(zhì) 5.色譜法色譜法是常用的純化多糖的方法，包括離子交換色譜和凝膠色譜，色譜法是利用填料對不同種類的糖吸附作用的差異，使混合物中各糖分達到彼此分離的方法。逆流色譜（Countercurrent chromatography，CCC）技術(shù)是一種無固體載體的連續(xù)液液分配色譜技術(shù)，其固定相通過重力場和離心力場作用被保留在分離柱內(nèi)，流動相與固定相在色譜儀內(nèi)進行分配，而達到物質(zhì)的分離。逆流色譜與傳統(tǒng)色譜相比具有無死吸附、進樣量大、分離純度高等顯著的優(yōu)勢，在食品、生物化工、制藥等

12、領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在海帶多糖7的分離純化中使用了該技術(shù)。用泵把固定相從進口注入HSCCC分離柱中，待固定相充滿后，開動主機，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速達到預(yù)定轉(zhuǎn)速并穩(wěn)定后，用20ml固定相溶解0.15g精制多糖，用恒流泵將樣品溶液以一定流速注入HSCCC，部分收集器收集。分離完成后，停止轉(zhuǎn)動。用氣泵使HSCCC中的液體流出。使用了逆流色譜分離多糖的雙水相系統(tǒng)，在PEG1000濃度為12%，KH2PO4濃度為8%，K2HPO4 濃度為8%，轉(zhuǎn)速在400r/min時，可以使海帶多糖達到很好的分離。下圖為逆流色譜儀示意圖。 6.制備性區(qū)帶電泳根據(jù)各種多糖的分子大小，形狀及其所帶電荷的不同可用電泳法進行分離。 7

13、.固定化凝集素的親和層析法近年來根據(jù)凝集素能專一地、可逆地與游離的和復(fù)合糖中的單糖和寡糖結(jié)合的性質(zhì)，利用固定化凝集素親和層析作為分離純化糖蛋白的方法。這一方法簡單易行，在溫和條件下進行不破壞糖蛋白活性。固定化的刀豆凝集素（concanavalin A，Con A）是應(yīng)用最普遍的固定化凝集素。Con A能專一地與甘露糖基結(jié)合，各種的酶如-和-半乳糖苷酶、過氧化氫酶、干擾素等都可用固定化Con A純化。 8.膜分離法膜分離具有無相變及化學(xué)變化、可常溫操作、選擇性高與能耗低等優(yōu)點。如馬尾藻多糖就采用了膜分離純化技術(shù)。海藻多糖是一類組成相當(dāng)復(fù)雜的生物大分子，使用膜分離技術(shù)對海藻多糖8進行分級可達到初步

14、純化的目的。在壓力05MPa， 溫度20條件下， 將脫蛋白之后的提取液稀釋至1 L， 先用孔徑01 m 的微濾膜過濾，分成濃縮液和透過液，將透過液依次用截留分子量為100、50、10、3kD 的超濾膜進行超濾，分別收集濃縮液和透過液。 近20 年來, 由于分子生物學(xué)的發(fā)展, 人們逐漸認(rèn)識到糖及其復(fù)合物分子具有極其重要的生物功能, 快速高效、節(jié)省能源、簡便易行的提取與純化工藝對多糖的研究有重要意義。多糖在自然界植物中廣泛存在，但由于其種類的多樣性、結(jié)構(gòu)組成的復(fù)雜性以及多糖分子量大、極性大等特點，給植物多糖提取、分離帶來很大困難，要想獲得較高的多糖提取率，用單一的提取方法不一定能取得理想的效果，將

15、2種或者多種提取方法結(jié)合可能得較好的提取效果9。在多糖的分離、純化中常用分級沉淀法、纖維素柱色譜法和凝膠色譜法相結(jié)合的方法進行分離、純化，使多糖的分離、純化能達到理想的效果。目前較為常用的提取與純化技術(shù)比較成熟, 但存在溶劑、能源消耗大且效率不高的問題, 合理使用一些新技術(shù)可以有效改善提取與純化效果, 使多糖制備向高效節(jié)能的方向發(fā)展; 不斷探索和完善的提取與純化技術(shù), 將會使多糖制備向綠色、現(xiàn)代化的方向發(fā)展。多糖的提取分離純化方法在不斷更新，在選取方法時，應(yīng)當(dāng)關(guān)注目標(biāo)多糖的性質(zhì)、特點，綜合比較進行實驗，才能選取最佳的方法和工藝。參考文獻1Yuanfeng Wang,Lan Yu1,Jiache

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