全版副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法.doc

1、精品.副溶血性弧菌（Vibrioparahacmolyticus）是廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚(yú)貝類 中的海洋性細(xì)菌，為海產(chǎn)食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海 地區(qū)，經(jīng)常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。在非沿海地 區(qū)，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時(shí)有發(fā)生。為保障食品衛(wèi)生質(zhì)量和食用安全，根 據(jù)副溶血性弧菌的特性，進(jìn)行下列檢驗(yàn)，以便鑒別診斷。第一節(jié)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法一、檢驗(yàn)方法（-）操作步驟1. 分離培養(yǎng)：首先稱取樣品25g,加225mL3.5%火菌鹽水，用均質(zhì)器打碎或用乳缽磨碎， 接種氯化鈉瓊脂平板和嗜鹽性瓊脂平板各一個(gè)

2、，同時(shí)取10mL加入100mL增菌液中，放 37C816h培養(yǎng)后，涂上述平板進(jìn)行分離，37C培養(yǎng)1824h取出觀察，挑取可疑菌落，轉(zhuǎn) 種3.5%氯化鈉三糖鐵斜而，37C、24h觀察結(jié)果。2. 涂片鏡檢：將三糖鐵培養(yǎng)基上反應(yīng)可疑者即底層變黃（匍萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）、上層斜而不 變（乳糖、蔗糖不分解）、有動(dòng)力、不產(chǎn)生硫化氫，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢形態(tài)。3. 嗜鹽性試驗(yàn)：將上述可疑培養(yǎng)物分別接種不同含量的鹽腺水（0%, 3%, 7%, 10%）于 37C24h培養(yǎng)后觀察生長(zhǎng)情況，在無(wú)鹽和10%鹽的腺水中不生長(zhǎng)，在3%和7%鹽的丿凍水中 生長(zhǎng)良好者，繼續(xù)進(jìn)行下列有關(guān)試驗(yàn)。4. 生化試驗(yàn)：分別接種下列各類生化培

3、養(yǎng)基，匍萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛 基質(zhì)、V-P,賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗(yàn)，放37C培養(yǎng)，除V-P、靛基 質(zhì)和甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)48h后加試劑觀察外，英他均在24h觀察結(jié)果。5. 動(dòng)物試驗(yàn)：將上述符合各類反應(yīng)的副溶血性弧菌，接種3.5%氯化鈉淼水，經(jīng)37C、1618h 培養(yǎng)后，小鼠腹腔注射0.3mL,觀察23d,將死亡小鼠進(jìn)行解剖作分離培養(yǎng)。（二）檢驗(yàn)程序圖6-1副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序二、結(jié)果分析判宦及注意事項(xiàng)（-）樣品處理采樣時(shí)應(yīng)注意首選準(zhǔn)備好滅菌用具及容器，以無(wú)菌手續(xù)取有代表性的樣品，樣品必須盡快送 檢，不宜存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于低溫

4、生存，在寒冷 的情況下容易死亡，防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果。對(duì)采取的樣品有時(shí)因受存放條件的影響（如低溫冷凍或干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因），使菌體處于 受傷狀態(tài)，故需對(duì)此類可疑食品或可疑中毒材料進(jìn)行增菌培養(yǎng)，但應(yīng)注意為有利于細(xì)菌恢復(fù), 不宜選用抑制性較強(qiáng)的培養(yǎng)基，否則影響細(xì)菌生長(zhǎng)。樣品經(jīng)增菌816h后，轉(zhuǎn)種平板進(jìn)行分離，挑選可疑菌落，接種于含有3.5%鹽的三糖鐵培 養(yǎng)基，此時(shí)挑選數(shù)目不應(yīng)少于5個(gè)，尤其夏季海產(chǎn)食品混放，相互污染嚴(yán)重，時(shí)有不同型別 的大量細(xì)菌存在，以防漏檢。（二）形態(tài)與染色為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，易呈多形態(tài)，有棒狀、呱狀、卵圓狀、球狀、絲狀等，排列不規(guī) 則，多數(shù)散在，偶而有成對(duì)排列

5、，一般大小為0.30.7umxl2um,單端一根鞭毛，有動(dòng)力, 運(yùn)動(dòng)活潑，兩端濃染，在固體培養(yǎng)條件下能生長(zhǎng)周鞭毛。（三）培養(yǎng)特性在普通瓊脂培養(yǎng)基和普通液體培養(yǎng)基中都可生長(zhǎng)，在無(wú)鹽的條件下不生長(zhǎng)，在含2%3%氮 化鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最旺盛，氯化鈉溶液濃度到達(dá)10%以上時(shí)不繁殖。在肉湯和丿凍水等液體培養(yǎng)基中混濁生長(zhǎng)，需氧性強(qiáng)，常在液體表而形成菌膜，在液體培養(yǎng)條 件下菌體多生長(zhǎng)為單鞭毛，運(yùn)行活潑。在固體培養(yǎng)基上，菌落常為隆起，圓形，稍混濁不透 明，表面光滑，濕潤(rùn)，不產(chǎn)生色素。在比較新鮮濕潤(rùn)或軟瓊脂培養(yǎng)基上，有些副溶他性弧菌 可形成不規(guī)則菌落或片狀擴(kuò)散生長(zhǎng)，在0.7%以上瓊脂的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)周鞭毛（側(cè)毛

6、）。- 般在2025C培養(yǎng)生長(zhǎng)的周鞭毛較為穩(wěn)左，而在37C培養(yǎng)或24h以上的培養(yǎng)物，周鞭毛易于 由菌體自發(fā)脫落，具有周鞭毛的菌株，在固體培養(yǎng)基上多表現(xiàn)擴(kuò)散生長(zhǎng)，單鞭毛的菌株在固 體培養(yǎng)基上呈典型菌落，不表現(xiàn)擴(kuò)散生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的成分、種類、溫度、濕度等條件的不同，都能對(duì)擴(kuò)散生長(zhǎng)有所影響，菌落形態(tài)也容 易受條件的影響有所改變，如在嗜鹽性平板上一般生長(zhǎng)良好，而在SS瓊脂平板上多呈較小 的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生長(zhǎng)快可出現(xiàn)溶血環(huán)，在BCBS （硫代硫酸鹽，檸掾酸 鹽，膽鹽，蔗糖）和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上，呈淡藍(lán)或藍(lán)綠色菌落。一般由腹瀉病人初期分 離者多為典型菌落，長(zhǎng)期保存的細(xì)菌或條件不適宜時(shí)，常有

7、菌落變粗糙，形狀不整齊或菌落 出現(xiàn)解離，有的在液體培養(yǎng)時(shí)呈沉淀生長(zhǎng)現(xiàn)象。pH生長(zhǎng)范用為5-10,最適pH為7.28.2,發(fā)育最適溫度為30-37C（四）生化特性本菌對(duì)匍萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘需醇，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫, 甲基紅陽(yáng)性，V-P陰性，賴氨酸陽(yáng)性，精氨酸陰性，鳥(niǎo)氨酸多數(shù)為陽(yáng)性少數(shù)呈陰性，溶血性 多數(shù)陽(yáng)性，有少數(shù)不溶血，主要生物化學(xué)性狀見(jiàn)表6-1。近年來(lái)由于細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)研究的深入和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，逐漸對(duì)一些海水來(lái)源的嗜鹽性弧菌有 所認(rèn)識(shí)，對(duì)其主要生化學(xué)性狀與副溶血性弧菌的比較見(jiàn)表6-2。表6J副溶血性弧菌的主要生物化學(xué)性狀項(xiàng)目項(xiàng)目耐鹽性0%-甲基紅+1%+V Ihp

8、10%靛基質(zhì)+術(shù)萄糖產(chǎn)酸+賴氨酸+葡萄糖產(chǎn)氣鳥(niǎo)氨酸精氨酸甘露醇+溶血性+/_硫化氫注：+陽(yáng)性：一陰性：+/多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性。表6-2副溶血性呱菌與其他弧菌的鑒別氧萄賴精鳥(niǎo)錠明膠V!乳甘-廿 阿拉鼠P半乳鹽 泳蔗肌菌名化糖產(chǎn)氨氨基露“仏露李班H酸丄腺液化P糠酹伯糖糖昔動(dòng)氣酸酸酸質(zhì)糖糖鹽水,%0 6 8 10副溶血性弧菌+一 d+d 4v.paruhuemoly-ticus溶藻弧菌v.alginolyicus+ + + F4d01霍亂弧菌v.choleraeoi+d (d) + + +d 非5霍亂弧菌v.cholerae nonoj+d (d) + +d+ +d +d 擬態(tài)弧菌v.mimicus

9、+ +一 (d) 一 + +4d 河弧菌 v.fluialis+ d+d+_ _ + +_ +d d+ +4d創(chuàng)傷弧菌u ridnificus+ d d+ +d 梅氏弧菌v.metschnikouiid+d+ d +亠dddd 霍利斯弧菌v.hollisae+_ +d v.damsela d+d 注：+90%以上為陽(yáng)性：一90%以上為陰性：（+ ）遲緩陽(yáng)性：d 11%89%為陽(yáng)性；（d） 11-89%遲緩陽(yáng)性。（五）溶血性試驗(yàn)我妻氏用高鹽血瓊脂培養(yǎng)基，在限泄的條件下培養(yǎng)副溶血性弧菌時(shí)岀現(xiàn)的溶血反應(yīng)，稱此溶 血性能為“神奈川現(xiàn)象”。此試驗(yàn)要求是用人或兔的新鮮紅血球制備高鹽血平板，經(jīng)37C、24h

10、培養(yǎng)，如在單個(gè)菌落周 由呈現(xiàn)透明溶血環(huán)或在菌落下而有明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象“陽(yáng)性，若不出現(xiàn)透明溶血環(huán) 或無(wú)明顯溶血者，為“神奈川現(xiàn)象陰性。有致病性的副溶他性弧菌，多數(shù)為神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性，但亦有少數(shù)為陰性。（六）動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)上述檢驗(yàn)的可疑菌株，用小鼠測(cè)左毒力，將1618h的蛋白腺水或肉湯培養(yǎng)物，注射小鼠 腹腔O.3O.5mL,有毒力者可在510h發(fā)病死亡，長(zhǎng)者有24h左右發(fā)病死亡。發(fā)病時(shí)有豎毛、 運(yùn)動(dòng)不活潑，腹部緊貼罐底，呼吸困難，四肢抽搐、尾部痙攣震頤等癥狀。將死亡小鼠解剖 后，取心血等內(nèi)臟進(jìn)行分離，可檢岀試驗(yàn)菌的純培養(yǎng)。對(duì)照動(dòng)物觀察23d無(wú)異常現(xiàn)象。 但應(yīng)注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死

11、亡，有時(shí)不易區(qū)別，需要上述毓的檢驗(yàn)后，進(jìn) 行毒力證實(shí)，綜合判泄結(jié)果。三、培養(yǎng)基（-）氯化鈉結(jié)晶紫增菌液成分：蛋白腺20g氯化鈉40g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸例水lOOOmLpH9.0制法：除結(jié)晶紫外其他按上述成分配好，加熱溶解，約加3%氫氧化鉀溶液4.5mL,校正pH, 加熱煮沸，過(guò)濾，再加入結(jié)晶紫溶液，混合分裝試管，121C髙壓滅菌15min。（二）氯化鈉慝糖瓊脂成分:蛋白腺10g牛肉膏10g氯化鈉50g蔗糖10g瓊脂18g0.2%瀆聯(lián)香草酚藍(lán)溶液20mL蒸錮水lOOOmLpH7.8制法：將牛肉膏.蛋白丿I東及氮化鈉溶解于蒸憎水中，校正pH,加入瓊脂，加熱溶解，過(guò)濾, 加入指示劑，分裝燒

12、瓶100mL, 121C高壓火菌15min備用。臨用前在100mL培養(yǎng)基內(nèi)加 入蔗糖lg,加熱溶化，冷至50C傾注平板。（三）嗜鹽菌選擇性培養(yǎng)基蛋白淼20g氮化鈉40g瓊脂17g0.01%結(jié)晶紫溶液5mL蒸飭水lOOOmL成分:pH8.7制法：除結(jié)晶紫和瓊脂外.其他按上述成分配好，校正pH,加入瓊脂，加熱溶解，再加結(jié) 晶紫溶液，分裝燒瓶，每瓶100mL。（四）3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂成分：貴白淼20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖lg氮化鈉35g硫酸亞鐵錢0.2g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12g酚紅O.O25g蒸錮水lOOOmLpH7.4制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸憎水中，校正p

13、H,加入瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，加入0.2%酚紅溶液12.5mL,搖勻,分裝試管,12KC高壓滅菌15min,放置高層 斜面?zhèn)溆?。（五）氯化鈉血瓊脂（我妻氏培養(yǎng)基）成分：酵母膏3g蛋白腺10g氯化鈉70g磷酸氫二鈉5g甘露醇log結(jié)晶紫0.00 lg瓊脂15g蒸錮水I OOOmL制法：調(diào)pH8.0,加熱30min（不必高壓人待冷至45C左右時(shí)，加入新鮮人或兔血（5%10% ）, 混合均勻，傾注平皿。（六）嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基成分：蛋白淼氯化鈉蒸錮水2g按不同址加入100mLpH7.7（七）3.5%氯化鈉生化試驗(yàn)培養(yǎng)基成分：牛肉膏5g蛋白腺10g氯化鈉35g磷酸氫二鈉2g0.2%瀆粘香草酚藍(lán)溶液1

14、2mL蒸錨水1 OOOmLpH7.7制法：將上述成分配好后，根據(jù)所需的糖發(fā)酵管分別加入各種糖類，匍萄糖發(fā)酵管可按0.5% 匍萄糖加入后，分裝有小倒管的試管內(nèi)，121C高壓滅菌15mino H他培養(yǎng)基可分裝為每瓶 lOOmL, 12KC高壓滅菌15min,另將各糖類分別配好10%溶液,同時(shí)高壓滅菌后,取5mL 糖液，加入100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無(wú)菌操作分裝小試管。（八）窗萄糖食鹽陳水（MR-VP試驗(yàn)用）成分：多腺5g葡萄糖5g磷酸氫二鉀5g氮化鈉30g制法：加入1 OOOmL蒸懈水，振搖加熱，使全部溶解，冷卻后分裝小試管，121C髙壓火菌15mino（九）食鹽腺水（靛基質(zhì)試驗(yàn)用）成分：蛋白腺20g

15、氯化鈉蒸錮水30glOOOmLpH7.4制法：按上述分配制,分裝小試管,12KC高壓滅菌15min（十）運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白腺10g氯化鈉30g瓊脂4g制法：將全部成分加入lOOOmL蒸鐳水，加熱溶解，分裝試管，12C15min髙壓滅菌，最 終 pH7.4第二r；副溶血性弧菌參考檢驗(yàn)方法一、日本食品微生物檢驗(yàn)方法（一）分離、菌數(shù)測(cè)泄圖62分離、菌數(shù)測(cè)定程序（二）鑒定將TCBS平板上生長(zhǎng)典型或可疑的菌落挑取2個(gè)以上，接種以下培養(yǎng)基:圖63鑒左程序（三）檢査用培養(yǎng)基1.3%氯化鈉蛋白丿凍稀釋液：蛋白腺10g、氯化鈉30g溶于lOOOmL蒸餾水中，校正pH7.O, 12rC15min

16、髙壓滅菌。2. TCBS成分：酵母膏5g蛋白淼10g蔗糖20g硫代硫酸鈉10g檸愫酸鈉10g精品.牛膽酸鈉3g牛膽汁粉5g氯化鈉log檸朦酸鐵lg渙略香草酚藍(lán)（2%溶液）20mL草酚藍(lán)（1%溶液）4mL瓊脂15gpH8.6制法：將上述成分加蒸餾水至lOOOmL,混合，使全部溶解，校正pH為86加熱煮沸，不 需高壓滅菌，傾注平皿1520mL。不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈藍(lán)綠色菌落，分解蔗糖的細(xì)菌呈黃色菌落。3.我妻氏瓊脂（改良）培養(yǎng)基成分：酵母膏5g蛋白淼10g氯化鈉70g廿靈醉5g結(jié)晶紫（0.1%酒精溶液） ImL 瓊脂15g制法：將全部成分溶于1000mL蒸館水中，調(diào)正pH為

17、7.5,至完全溶解后，加熱煮沸數(shù)分 鐘，不需高壓火菌，冷卻至50C時(shí)，加入洗凈的20%濃度的人紅血球懸液lOOmL,混合均 勻后傾注平皿。紅血球懸液的制備：將人的脫纖維血液，離心沉淀的血球，用0.85%火菌生理鹽水洗3次, 最后沉淀的紅血球，用生理鹽水制成1:4的懸液。4 亞硫酸鈕肉湯成分：蛋白淼log氯化鈉25g氮化鉀0.7g氯化鎂5g制法：加蒸餾水950mL溶解，調(diào)pH為9.h 12KC高壓滅菌15miib室溫冷卻，加亞硫酸鈕 溶液100mL及95%灑精I(xiàn)mL,混勻，無(wú)菌手續(xù)加入火菌試管，每管100mL,不需加熱。亞硫酸鈕溶液配制：熱水100mL,加亞硫酸鈉20g：熱水100mL加檸檬酸W

18、 O.lg； 將加溶解甘露醇20g,煮沸l(wèi)min,最終成白色混濁的混合物，使用前搖勻。于冷庫(kù) 貯存，可使用1個(gè)月。5. 食鹽碳水化合物肉湯基礎(chǔ)液成分：蛋白腺2g硫酸鈉2.5g氮化鍍5g磷酸二氫鈉0.5g磷酸氫二鈉1.5g0.2%瀆聃香草酚藍(lán)溶液12mL精品.制法：將全部成分溶于1000人工海水中，分裝試管，每管5mL, 121C15min高壓滅菌，冷 卻后分別加碳水化合物10%滅菌溶液0.5n】L。碳水化合物溶液需過(guò)濾或115ri0min高壓火 菌。人工海水的配制：氯化鈉23.4g,氯化鉀0.66g,硫酸鈉3.91g,重碳酸鈉0.19g,氯化鎂4.96g, 將上述全部成分溶于1000mL蒸憾水

19、。6. Hugh-Leifson食鹽培養(yǎng)基成分：賈白腺2g氮酸鈉30g磷酸氫二鉀03g葡萄糖10g瓊脂4g0.2%瀆翳香草酚藍(lán)溶液12mL蒸錨水lOOOmLpH7.4制法：將上述成分溶解，調(diào)pH后加指示劑，分裝試管,每管3mL, 121C高壓滅菌15min。 試驗(yàn)方法：穿刺接種兩種，一管加礦物油覆蓋表面，于3537C培養(yǎng)，兩管同時(shí)變黃為葡萄 糖發(fā)酵，只有不加礦物汕的培養(yǎng)管變黃時(shí)為葡萄氧化。二、耐熱溶血毒檢驗(yàn)方法根據(jù)試驗(yàn)證明，神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性菌株，多數(shù)對(duì)人的致病性有密切關(guān)系，神奈川現(xiàn)象的陽(yáng)性物 質(zhì)稱“耐熱性溶血素”，檢驗(yàn)副溶血性弧菌是否產(chǎn)生耐熱性溶血毒，可參考下述方法：（一）Sahuria （櫻井

20、氏）法用副溶他性弧菌肉湯培養(yǎng)物上淸液為抗原,與制備的精制耐熱性溶血毒的抗血淸進(jìn)行瓊脂擴(kuò) 散試驗(yàn)，觀察沉淀線。（二）Eick法（本田改良法）以微研No.l瓊脂（Difco腺30g，磷酸氫二鈉30g,氯化鈉40g,葡萄糖5g,瓊脂15g,蒸 館冰1000mL, pH7.3）培養(yǎng)37C過(guò)夜，在平板上菌落旁約為5mm處放一小濾紙片（上吸有 抗血淸），室溫放一夜，觀察濾紙旁有無(wú)沉淀紅。（三）液體培養(yǎng)檢驗(yàn)法（飯?zhí)锩瘢┯?%氯化鈉肉湯，加入少雖新鮮紅血球，傾斜培養(yǎng)，神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性菌株能引起溶血，而 陰性菌株不溶血。（四）反相被動(dòng)血球凝集法（太田氏）用吸附抗體的紅血球測(cè)定抗原（溶血毒），此方法極為敏感，可查岀微量耐熱性溶血毒。并 發(fā)現(xiàn)神奈川現(xiàn)象陰性的菌株也產(chǎn)生少量的耐熱性溶血毒。三、至病性試驗(yàn)方法（-）兔腸禪結(jié)扎試驗(yàn)選用正常健康家兔，首選使家兔斷食24h,用乙礎(chǔ)麻醉，將腹壁切口，露出小腸，選取腸段 約5cm左右，于兩端結(jié)扎，注入檢菌的肉湯培養(yǎng)物，同時(shí)另選兩段作陽(yáng)性和陰性對(duì)照，然 后迅速縫合，24h后由耳靜脈注入空氣殺死，開(kāi)腹檢査，有致病性者注菌腸段可見(jiàn)腫脹積液,出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。一般認(rèn)為神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性菌株，兔腸祥結(jié)扎試驗(yàn)多數(shù)為陽(yáng)性反應(yīng)，神奈川現(xiàn)象陰性菌株多數(shù) 為陰性，但亦有少