消毒劑消毒效力及有效期驗證方案

1、湖北普愛藥業(yè)有限公司驗證管理標準文件第1頁 共5頁消毒劑滅菌效果驗證消毒劑滅菌效果驗證一消毒劑的選用原則：目的：確認各潔凈級別的操作間尺設備外表面按照規(guī)定的消毒程序消毒能夠達到消毒、防止污染的目的，并在消毒劑有效期內能確保其消毒效力能符合要求。范圍：本驗證方案適用于本公司潔凈區(qū)的墻面、天花板、門窗、機器設備、儀器、操作臺、地漏、推車、桌椅等表面以及操作人員雙手（手真）的消毒等。1- 參考文件1 -1 醫(yī)療器械生產質量管理規(guī)范1- 2-中國藥典2015版 第4部 微生物限度檢査法2- 概述21.本公司的潔凈區(qū)為D級，擬定用于潔凈區(qū)表面消毒的有五種消毒劑：75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、2%新潔

2、爾滅溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、（）.1%醋酸孰己定溶液。本次驗證方案將選用以上5種消毒劑分別進行驗證試驗。作用對象一樣的消毒劑每月輪換使用，避免表面微生物產生耐藥菌株。在利用消毒劑進行表面擦拭消毒過程中消毒劑的作用時間應不少于10分鐘，利用消毒劑進行浸泡消毒的不少于5分鐘。消毒劑的種類、消毒對象、消毒方法和有效期序 號名稱消毒對象消毒方法有效期175%乙醇用于設備表面、器具和手消毒。采用擦拭或噴 灑方式密閉保存D級：30天20.1%新潔爾火 溶液用于地而、墻而、器具、工作服、 淸潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用擦拭或浸 泡方式密閉保存D級：30 天30.2%的新潔爾 滅溶液用于水池和地漏的消毒

3、用于液封密閉保存D級：30 天40.5%醋酸氯己 怎溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級：30 天50.1酸氯己定溶液用于工作服、淸潔布、拖布和潔 凈鞋的消毒采用浸泡方式密閉保存D級：30天22 為了確認消毒劑的消毒效力，通過實驗室考察部分和現(xiàn)場考察部分分別進行驗證。其中, 用定量懸浮試驗法和表面實驗法進行實驗室誇察試驗部分。潔浄區(qū)設施表面材質基本都是不銹鋼和玻璃兩種，故表面試驗法選用不銹鋼載片和玻璃 裁片模擬潔浄區(qū)設施表面進行驗證試驗。兩種試驗方法作用的消毒劑見表。序號試驗方法消毒劑1表面實驗法75%乙醇20.1%新潔爾滅溶液3定量懸浮試驗法0.3%的新潔爾滅溶液40.1%新潔爾滅溶

4、液50.5%醋酸氯己定溶液60.1%醋酸氯己定溶液現(xiàn)場考察試驗部分選擇車間（D級）的配液間、灌裝間設備表面消毒前和消毒后分別進行 取樣，測定其微生物數(shù)量。3- 確認前準備3-1-驗證用試劑與材料3.1.1.菌序號名稱序列號1金黃色葡萄球菌CMCC(B)260032大腸埃希菌CMCC(B)441023枯草桿菌芽抱CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F) 980013.1.2.序號名稱備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經121C, 20min火菌備用2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3胰酪大豆腺瓊脂培養(yǎng)基4胰酪大豆腺培養(yǎng)基5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）規(guī)格：055mm,取樣而積為25m26玫

5、瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)接觸碟（編號：BZW15129）培養(yǎng)基3.1.3.序號消毒劑名稱中和劑備注175%乙醇中和劑經20.1%新潔爾滅溶液1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80121C, 20min30.2%的新潔爾滅溶液滅菌備用。消毒液擬定選用的中和劑3-1-4-稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液（NS）3.1.5.器具及設備序號名稱1無菌移液管2錐形瓶3無菌試管4恒溫水浴鍋5恒溫恒濕培養(yǎng)箱6恒溫恒濕培養(yǎng)箱3- 2-驗證用試劑與材料記錄見附錄1。4- 消簿劑消毒效力試驗4-1-中和劑鑒定試驗4工試驗目的通過該試驗，確認所用的中和劑對對應的消毒劑有良好的中和作用，對試驗用菌劑及其 恢復期培養(yǎng)示范有害或不良影響。4

6、1-2-菌液的制備及計數(shù)4.12金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽總菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孑包菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 3035C培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用（）.9%無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成 1 X 108-5X10HCFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1 X 10*5X CFU/ml, 可不再用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋）。計數(shù)時，將1 X 5X lOpFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50l（）（）CFU/ml菌液, 并同時采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3（）35C培養(yǎng)2天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計 數(shù)結果換算成每

7、毫升濃菌液的菌落數(shù)。41-2-白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，2328C培養(yǎng)2448小時。取上 述培養(yǎng)物用（）.9%無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1 X 1（）5 X 10HCFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1 X 1（卜5X l（FCFU/ml,可不再用（）.9%無菌氯化鈉溶液稀湖北普愛藥業(yè)有限公司驗證管理標準文件第1頁 共5頁消毒劑滅菌效果驗證一釋）。計數(shù)時,將1 X 105X108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含501O0CFU/ml 菌液，并同時采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2328匕培養(yǎng)3天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌 落數(shù)，將計數(shù)結

8、果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。41 *3鑒定試驗操作4工3配制75%乙醇、（）.1%新潔爾滅溶液、0.2%新潔爾滅溶液、40mg/L的二氧化氯、6Omg/L 的二氧化氫，具體操作執(zhí)行清潔劑和消毒劑管理。將配置好的消毒劑置20C 1 C 恒溫水浴鍋中備用。41-3-分組操作試驗分組尺稀釋操作方法簡表組號混合液A混勻作用混合液B混勻作用取混合液B或混合液B的稀釋級溶液0.5ml 平板計數(shù)（2皿/組）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A 0.5ml加入下列溶液1消毒劑4.5ml稀釋液4.5ml混合液B、10-12消毒劑4.5ml中和劑45ml混合液B、10-13中和劑4.5ml10min稀釋

9、液4.5ml10ming IO34中和產物4.5ml（7肖 毒液與中和劑比例X 1:1稀釋液4.5ml10 0-35稀釋液4.5ml稀釋液4.5ml102 10-36稀釋液和中和劑1 .Oml注入無菌平皿中，齊制備2皿。具體操作 第1組目的：觀察消毒液對試驗菌有無殺滅或抑制能力。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用lOmin后,取混合液0.5ml+稀釋液4.5ml,混 勻作用lOmin,?。ǎ?5ml注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿消毒劑滅菌效果驗證菌芽總菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基，倒置2328C培養(yǎng)

10、5天計數(shù)計數(shù)。第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗菌是否恢復生長。操作：取消毒劑4.汕1+工作菌液0.5ml,混勻作用lOmin后，取混合液0.5ml +中和劑4.5ml,混勻作用lOmin,用稀釋液稀釋成1（尸。分別取未稀釋溶液（混合液0.5mll+中和劑4.5ml 的混合液）及1（）.5注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草 桿菌芽彳包菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉 瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328C培養(yǎng)5天計數(shù)。第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性操作：取中和劑4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用lOmin,取混合液

11、0.5ml 1+稀釋液4.5ml,混 勻作用lOmin后，用稀釋液進行1（）倍系列稀釋成1（尸、1（尸。取相應稀釋級0.5ml注皿， 各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽鞄菌用營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基，倒置3（）35C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035C 培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。第4組目的：觀察中和產物，或未被完全中和殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。 操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用lOmin,取混合液（）.5ml消毒劑滅菌效果驗證一1+稀釋液4.5ml,混勻作用lOmin后，用稀釋液進行1()倍系列稀釋成1

12、(尸、1(尸。取相應 稀釋級().5別注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌 芽彳包菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培 養(yǎng)基，倒置3()35C培養(yǎng)3天計。第5組目的：作菌落數(shù)對照用操作：取稀釋液4.5ml+工作菌液0.5ml,混勻作用lOmin,取混合液0.5ml 1+稀釋液4.5ml,混 勻作用lOmin后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成1(尸、10-取相應稀釋級().5ml注皿， 各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孑包菌用營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基，倒置3()35C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，

13、倒置3035C 培養(yǎng)3天計數(shù)。第6組目的：作為陰性對照用操作：分別取稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿。4.13結果判斷試驗結果應符合下列全部條件，判斷所選中和劑合格。第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長。第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)05X(x+5)湖北普愛藥業(yè)有限公司驗證管理標準文件第1頁 共5頁y（y+0.5y）第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%。計算公式如 下：（3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和誤差率=X100 %3X3組間菌落平均數(shù)第6組

14、無菌生長。否則，說明試劑有污染，應重新進行試驗。4.14中和劑鑒定試驗記錄見附錄2。42定量懸浮試驗421 試驗目的由于0.2%的新潔爾滅溶液、（）.1%新潔爾滅溶液、60mg/L -氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己 定溶液、（）醋酸氣己定溶液是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗，確定其消毒 效力是否符合要求。422.試驗操作422.配制（）.2%的新潔爾滅溶液、（）.1%新潔爾滅溶液、60mg/L-氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己 定溶液、（）醋酸氣己定溶液，操作執(zhí)行清潔劑和消毒劑管理。將配置好的消毒劑 置2（）C 1 C恒溫水浴鍋中備用。4.22由于0.2%的新潔爾滅溶液、（）.1%新潔爾滅溶液

15、中低效消毒劑，且不能殺滅芽鞄，故定量懸浮試驗用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。消毒劑滅菌效果驗證0.5%醋酸氫己定溶液、0.1%醋酸零己定溶液為髙效消毒劑，能殺滅芽孑包，故定量懸浮試 驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽彳包桿菌。4.22將菌液制備成1 x 105X108CFU/ml的工作菌液，菌液的制備及計數(shù)同&1.2。422將試管按需要分組排列在試管架上，試驗組分3組（4min、5min. 6min各一組）,并由左向右逐管標明消毒劑、中和劑、1（），、1（尸。對照組分1組，并由左向右逐管標明稀 釋液、中和劑、1（尸、1（產1（尸、1（產。422向個試管加入4.

16、5ml相應的試劑，標明10 10* 1（尸、10“加入4.5ml的稀釋液。422.吸取工作菌液0.5曲加入標明消毒劑的試管中，對照組加入標明稀釋液的試管中，迅速 混勻，并開始計時。422.待菌液與消毒劑相互作用至SmiiK lOmin. 12min,吸取菌液和消毒劑混合液0.5ml,加 入標明中和劑的試管中，迅速混勻。4.2.2.中和作用i（）min后，吸?。ǎ?5兇加入標明1（尸的試管中，混勻后吸?。ǎ?5兇加入標明1（尸 試管中（對照組以此類推，對照組直至1L）。422.試驗組分別取中和劑管、1（尸、IO-?管溶液按平皿法測定存活菌數(shù)；對照組取1（尸、10-4lml按平皿法測定存活菌數(shù)。每

17、管平行制備2皿。22.金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽扌包菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3（）35C 培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328C培養(yǎng)5天計數(shù)。423結果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度（CFU/ml）,并換算為對數(shù)值（N）,并按下式計算 殺滅對數(shù)值：殺滅對數(shù)值（KL）=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX）4.24可接受標準消毒劑滅菌效果驗證一殺滅對數(shù)值（KL）應不低于35個對數(shù)單位。425定量懸浮試驗記錄見附錄343表面試驗法431 試驗目的由于75%乙醇、40mg/L -氧化氯溶液、（）.1%新潔爾滅溶液是通過擦拭消毒，故選用不

18、 銹鋼載片和玻璃裁片進行表面試驗法，確定其消毒效力是否符合要求。32菌種選擇由于75%乙醇、（）.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽彳包，故定量懸浮試驗用 菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。（）.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸眾己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽砲，故定量懸浮試 驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孑包桿菌。433.工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度及驗證同步計數(shù)操作同&12。434試驗操作4.34（1）染菌不銹鋼載片制備將經滅菌的載片平鋪于無菌平皿內，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽彳包桿菌、白色念珠菌 含菌量為1 X105X108CFU的菌液0

19、.1ml,并均勻涂布于整個載體表面。滴染菌液后， 載片置超凈工作臺晾干后備用。每種菌平行制備兩個染菌不銹鋼載片。（2）染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的材質為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進行染菌試驗。進行菌液滴染前，用 記號筆在培養(yǎng)皿菌液滴染面的背面畫岀染菌面積（5（）mmX 50mm）,標注清晰。菌液滴染操作同染菌不銹鋼載片制備。消毒劑滅菌效果驗證一4.34 試驗組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時間分別為lOmin. 12min, 不銹鋼載片和玻璃載片每個作用時間分別制備2個。作用結束后，用接觸碟取樣（接觸 碟規(guī)格：55mm,取樣面積為25m）。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌

20、芽 砲菌用大豆酷蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）；取樣白色念珠菌用玫瑰紅 鈉瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW15129） o接觸碟取樣方法：打開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸 碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣面表面均勻接觸1（）秒左右，在蓋上跌蓋。對照組對照組的活菌濃度計數(shù)見&3.3。陰性對照：用接觸碟在已滅菌的載片上（未染菌片的載）按壓取樣，操作同上。每種載片及每種接 觸碟平行制備兩份。434.培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽砲菌的接觸碟倒置于3（）35C培養(yǎng)3 天計數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于2328C培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。34結果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度（CFU/兇），并換算為對數(shù)值（N）,并按下式計算 殺滅對數(shù)值：殺滅對數(shù)值（KL）=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX） 4.34可接受標準殺滅對數(shù)值（KL）應不低于35個對數(shù)單位。消毒劑滅菌效果驗證一4.3.5. 表面試驗法記錄見附錄5現(xiàn)場考察試驗441. 消毒前對潔凈區(qū)進行表面微生物取樣。取樣地點：D級車間的配料間墻壁和設備表面、灌裝間墻壁和設備表面、中間站墻壁表 面。取樣操作&檢驗執(zhí)行表面微生物檢驗。442. 生產操作結束后操作人員按照生產區(qū)清潔對潔凈區(qū)進行清潔消毒。443. 清潔消毒完畢15分鐘后，