微生物的生長和控制測定生長繁殖的方法

1、生長和繁殖是保證生長和繁殖是保證 微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提。微生物獲得巨大數(shù)量的必要前提。 生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體 體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。 生長生長（growth）：）： 生物個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生物個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的 生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。 繁殖繁殖（reproduction）：）： 生長是一個(gè)逐步發(fā)生的生長是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過程量變過程， 繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)

2、體的質(zhì)變過程質(zhì)變過程。 在高等生物里這在高等生物里這兩個(gè)過程兩個(gè)過程可以明顯分開，可以明顯分開， 但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小，但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小， 這兩個(gè)過程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。這兩個(gè)過程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。 生長和繁殖生長和繁殖 群體生長群體生長 = 個(gè)體生長個(gè)體生長 + 個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 個(gè)體生長個(gè)體生長 個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 群體生長群體生長 在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加（微生物群體生長）（微生物群體生長） 微生物生長微生物生長: 在微生物學(xué)中提到的在微生物學(xué)中提到的“生長生長”，一般均指群體生長，這

3、一點(diǎn)與，一般均指群體生長，這一點(diǎn)與 研究大生物時(shí)有所不同。研究大生物時(shí)有所不同。 第一節(jié)第一節(jié) 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 單位時(shí)間里單位時(shí)間里微生物數(shù)量微生物數(shù)量或或生物量生物量（Biomass）的變化的變化 微生物生長：微生物生長： 微生物生長的測定：微生物生長的測定： 個(gè)體計(jì)數(shù)個(gè)體計(jì)數(shù) 群體重量測定群體重量測定 群體生理指標(biāo)測定群體生理指標(biāo)測定 評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響； 評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死或殺死)作用的效果；作用的效果； 客觀地反映微生物生長的規(guī)律；客觀地反

4、映微生物生長的規(guī)律； 一、測生長量一、測生長量 測定生長量的方法很多，適用于一切微生物。測定生長量的方法很多，適用于一切微生物。 （一）（一）測生長量直接法測生長量直接法 （二）（二）測生長量間接法測生長量間接法 （一）測生長量直接法（一）測生長量直接法 測體積法測體積法：粗放型粗放型，在刻度離心管中測沉降量，在刻度離心管中測沉降量 稱干重法稱干重法：精確型精確型，離心法和過濾法獲得菌體細(xì)胞，離心法和過濾法獲得菌體細(xì)胞， 微生物的干重一般為其濕重的微生物的干重一般為其濕重的10102020。 測定多細(xì)胞及絲狀真菌生長情況的有效方法測定多細(xì)胞及絲狀真菌生長情況的有效方法 10 1.1.測體積：測

5、體積：在刻度離心在刻度離心 管中離心，管中離心，測定沉淀測定沉淀多多 少來確定微生物的生長少來確定微生物的生長 情況。情況。 2.2.測干重：測干重： 將細(xì)胞培養(yǎng)液離心將細(xì)胞培養(yǎng)液離心 或過濾后，洗滌除去培養(yǎng)基成或過濾后，洗滌除去培養(yǎng)基成 分后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，置分后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?100105干燥箱烘干干燥箱烘干或或低溫低低溫低 壓干燥（壓干燥（6080）至恒重后至恒重后， 稱重。稱重。 若是固體培養(yǎng)物，可先加若是固體培養(yǎng)物，可先加 熱溶解瓊脂，熱溶解瓊脂， 然后過濾出菌體，然后過濾出菌體， 洗滌、干燥后再稱重。該法適洗滌、干燥后再稱重。該法適 合于單細(xì)胞和多細(xì)胞微生物的合于單細(xì)胞

6、和多細(xì)胞微生物的 生長測定。生長測定。 （二）測生長量間接法（二）測生長量間接法 1.1.比濁法比濁法 用用分光光度法分光光度法對無色的微生物懸浮液進(jìn)行對無色的微生物懸浮液進(jìn)行 測定，一般選用測定，一般選用450450650650nmnm波段。波段。 實(shí)驗(yàn)測量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與實(shí)驗(yàn)測量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與 光密度成正比的線性范圍內(nèi)，光密度成正比的線性范圍內(nèi)， 否則不準(zhǔn)確。否則不準(zhǔn)確。 在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度 （optical density, 即即O.D.）表示菌量。表示菌量。 若要連續(xù)跟蹤某一培養(yǎng)物的生長動態(tài)，可用帶有若要連續(xù)跟蹤某

7、一培養(yǎng)物的生長動態(tài)，可用帶有 側(cè)臂的三角燒瓶作原位測定，即不必取樣。側(cè)臂的三角燒瓶作原位測定，即不必取樣。 2.2.生理指標(biāo)法生理指標(biāo)法 樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯， 因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等 設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。 微生物的生理指標(biāo)，如氮、碳、微生物的生理指標(biāo)，如氮、碳、DNA、ATP等物等物 質(zhì)的含量，呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等與其質(zhì)的含量，呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等與其 群體的規(guī)模群體的規(guī)模成正相關(guān)成正相關(guān)。 常

8、用于對微生物的快速鑒定與檢測常用于對微生物的快速鑒定與檢測 一種特定的微生物，每一個(gè)細(xì)胞中的一種特定的微生物，每一個(gè)細(xì)胞中的ATP濃度濃度 幾乎是一個(gè)常數(shù)，所以測定這種微生物的幾乎是一個(gè)常數(shù)，所以測定這種微生物的ATP含量，含量， 即可知其細(xì)胞數(shù)。即可知其細(xì)胞數(shù)。 已知細(xì)胞數(shù)的微生物樣品已知細(xì)胞數(shù)的微生物樣品 測定測定ATP含量含量 測定未知細(xì)胞數(shù)的測定未知細(xì)胞數(shù)的 微生物樣品的微生物樣品的ATP含量含量 換算出每個(gè)細(xì)胞所含的換算出每個(gè)細(xì)胞所含的ATP量量 即可算出未知樣中細(xì)胞數(shù)即可算出未知樣中細(xì)胞數(shù) 二、計(jì)繁殖數(shù)二、計(jì)繁殖數(shù) 測定繁殖，一定要測定繁殖，一定要一一計(jì)算一一計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目。各個(gè)

9、體的數(shù)目。 單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌 放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物 計(jì)算其計(jì)算其孢子孢子數(shù)數(shù) 計(jì)算計(jì)算細(xì)胞個(gè)體細(xì)胞個(gè)體的數(shù)目的數(shù)目 link1 （一）（一）計(jì)繁殖數(shù)直接法計(jì)繁殖數(shù)直接法 （二）（二）計(jì)繁殖數(shù)間接法計(jì)繁殖數(shù)間接法 （一）計(jì)繁殖數(shù)直接法（一）計(jì)繁殖數(shù)直接法 1. 計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法 指采用指采用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)板（細(xì)菌計(jì)數(shù)板細(xì)菌計(jì)數(shù)板或或血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板），）， 在光學(xué)顯微鏡下直接觀察微生物細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的在光學(xué)顯微鏡下直接觀察微生物細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的 方法。方法。 （計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量）（計(jì)算一定容積

10、里樣品中微生物的數(shù)量） 20 采用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞個(gè)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞個(gè)數(shù) 21 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度；需要相對高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察； 2. 染色后活菌計(jì)數(shù)法染色后活菌計(jì)數(shù)法 采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行采用特定的染色技術(shù)進(jìn)行活菌染色活菌染色，然后用光學(xué)顯，然后用光學(xué)顯 微鏡計(jì)數(shù)的方法?？煞謩e對活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。微鏡計(jì)數(shù)的方法?？煞謩e對活菌和死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。 例：美藍(lán)例：美藍(lán) 酵母酵母 活細(xì)胞活細(xì)胞無無色色 死細(xì)胞死細(xì)胞藍(lán)藍(lán)色色 E

11、g. 細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察 活細(xì)胞活細(xì)胞橙色熒光橙色熒光 死細(xì)胞死細(xì)胞綠色熒光綠色熒光 將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細(xì)胞將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細(xì)胞 細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比 例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。 4. 過濾計(jì)數(shù)法過濾計(jì)數(shù)法 當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、 海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干

12、燥、 染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上 （或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。（或一定面積中）的細(xì)菌數(shù)。 3. 比例計(jì)數(shù)法比例計(jì)數(shù)法 （二）計(jì)繁殖數(shù)間接法（二）計(jì)繁殖數(shù)間接法 是一種是一種活菌計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法，這是一種依據(jù)活菌在，這是一種依據(jù)活菌在液體培液體培 養(yǎng)基養(yǎng)基中會使其變混或在中會使其變混或在固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的上（內(nèi)）形成菌落的 原理而設(shè)計(jì)。原理而設(shè)計(jì)。 最常用的是最常用的是菌落計(jì)數(shù)法菌落計(jì)數(shù)法（colony-counting methods）。）。 1. 平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法 可用可用澆注平板澆注平板（pour

13、plate）或或涂布平板涂布平板 （spread plate）等方法進(jìn)行。此法適用于各種等方法進(jìn)行。此法適用于各種 好氧菌好氧菌或或厭氧菌厭氧菌。 采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確， 否則難以得到正確的結(jié)果。否則難以得到正確的結(jié)果。 樣品充分混勻；樣品充分混勻； 每支移液管及涂布棒只能接觸每支移液管及涂布棒只能接觸 一個(gè)稀釋度的菌液；一個(gè)稀釋度的菌液； 同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平取平 均值；均值； 每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適， 便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)； 一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一個(gè)

14、菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中 一般用一般用 菌落形成單位菌落形成單位（colony forming units， CFU）來表示，來表示， 而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。 根據(jù)每皿上形成的根據(jù)每皿上形成的CFU數(shù)乘上稀釋度可推算出菌數(shù)乘上稀釋度可推算出菌 樣的含菌數(shù)。此方法最為常用，但操作較繁瑣且要求樣的含菌數(shù)。此方法最為常用，但操作較繁瑣且要求 操作者技術(shù)熟練操作者技術(shù)熟練缺點(diǎn)。缺點(diǎn)。 國外出現(xiàn)了微型、快速、商品化的用于菌國外出現(xiàn)了微型、快速、商品化的用于菌 落計(jì)數(shù)的落計(jì)數(shù)的小型紙片小型紙片或或密封瓊脂板密封瓊脂板。原理是利。原理是利 用加在培養(yǎng)基中的用加在培養(yǎng)

15、基中的活菌指示劑活菌指示劑TTC（2，3，5 氯化三苯基四氮唑），氯化三苯基四氮唑），它可使菌落在很微小是它可使菌落在很微小是 就染成易于辨認(rèn)的玫瑰色。就染成易于辨認(rèn)的玫瑰色。 2. 膜過濾培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法膜過濾培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法 當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水 或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培 養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 3. 厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法 一般可用一般可用亨蓋特滾管培養(yǎng)法亨蓋特滾管培養(yǎng)法進(jìn)行。此

16、法進(jìn)行。此法 設(shè)備較復(fù)雜，技術(shù)難度很高。設(shè)備較復(fù)雜，技術(shù)難度很高。 簡便快速的簡便快速的半固體深層瓊脂法半固體深層瓊脂法，可測定，可測定雙歧桿雙歧桿 菌菌（bifidobacteria）和和乳酸菌乳酸菌（lactic acid bacteria） 等厭氧菌活菌數(shù)。等厭氧菌活菌數(shù)。 原理：原理： 試管中的深層半固體瓊脂有良好的厭氧性能，并試管中的深層半固體瓊脂有良好的厭氧性能，并 利用其凝固前可作稀釋用，凝固后又可代替瓊脂平板利用其凝固前可作稀釋用，凝固后又可代替瓊脂平板 作菌落計(jì)數(shù)用的良好性能。作菌落計(jì)數(shù)用的良好性能。 兼有省工、省料、省設(shè)備和菌落易辯認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)！兼有省工、省料、省設(shè)備和菌落易辯

17、認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)！ 群體生長群體生長 = 個(gè)體生長個(gè)體生長 + 個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 個(gè)體生長個(gè)體生長 個(gè)體繁殖個(gè)體繁殖 群體生長群體生長 在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加（微生物群體生長）（微生物群體生長） 微生物生長微生物生長: 在微生物學(xué)中提到的在微生物學(xué)中提到的“生長生長”，一般均指群體生長，這一點(diǎn)與，一般均指群體生長，這一點(diǎn)與 研究大生物時(shí)有所不同。研究大生物時(shí)有所不同。 第一節(jié)第一節(jié) 測定生長繁殖的方法測定生長繁殖的方法 2.2.測干重：測干重： 將細(xì)胞培養(yǎng)液離心將細(xì)胞培養(yǎng)液離心 或過濾后，洗滌除去培養(yǎng)基成或過濾后，洗滌除去培養(yǎng)基成 分后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，置分后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?100105干燥箱烘干干燥箱烘干或或低溫低低溫低 壓干燥（壓干燥（6080）至恒重后至恒重后， 稱重。稱重。 若是固體培養(yǎng)物，可先加若是固體培養(yǎng)物，可先加 熱溶解瓊脂，熱溶解瓊脂， 然后過濾出菌體，然后過濾出菌體， 洗滌、干燥后再稱重。該法適洗滌、干燥后再稱重。該法適 合于單細(xì)胞和多細(xì)胞微生物的合于單細(xì)胞和多細(xì)胞微生物的 生長測定。生長測定。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度；需要相對高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下