臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術：色譜柱技術（一）

1、第二章第二章 色譜技術概論色譜技術概論 - -色譜柱色譜柱 2017.03.21 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 一、教學要求 二、復習 三、氣相色譜柱 主要內(nèi)容 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 四、小結與思考 一、教學要求 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 目的及目標 熟悉氣相色譜柱和液相色譜柱的構造、分類及柱參數(shù)； 為后續(xù)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術章節(jié)的學習打下理論基礎。 教學要求 6/8/2021 教學形式及學時 教學形式：理論教學 學時：2 教學要求 二、復習 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 塔板理論公式：n = L / H 色譜柱長：L 理論塔板高度：H， 色譜柱的理論塔板數(shù)：n， 當色譜柱長度一定時，塔板數(shù) n 越大，塔板高度 H

2、越小，被測組分 在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效則越高，所得色譜峰越窄。 塔板理論 速率理論的范.弟姆特方程：H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度， u：載氣的線速度， A，B，C為常數(shù)，分別代表：A-渦流擴散項系數(shù)、B-分子擴散項系 數(shù)、C-傳質(zhì)阻力項系數(shù) 降低理論塔板高度，提高柱效的方式： 獲得最佳流速 減小A、B、C三項。 速率理論 氣相色譜儀的構造 五個基本組成系統(tǒng)：氣路系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測 系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。 二、氣相色譜柱 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 氣相色譜柱 柱參柱參 數(shù)數(shù) 分類分類 構造構造 構造 柱管材料：不銹鋼、玻璃、石英玻璃、聚四氟乙烯等 填充劑：固體吸

3、附劑、載體+固定液 不銹鋼柱不銹鋼柱 玻璃柱玻璃柱 石英玻璃柱石英玻璃柱 聚四氟乙烯柱聚四氟乙烯柱 柱材料柱材料 氣固吸附色譜柱氣固吸附色譜柱 氣液分配色譜柱氣液分配色譜柱 填充劑及填充劑及 吸附機理吸附機理 非極性非極性 極性極性 手性手性 固定液固定液 化學性能化學性能 填充氣相色譜柱填充氣相色譜柱 毛細管氣相色譜柱毛細管氣相色譜柱 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑 大小和長度大小和長度 分類 填充氣相填充氣相 色譜柱色譜柱 結構結構 柱管材料柱管材料 形狀形狀 固定相固定相 填充氣相色譜柱 填充氣相色譜柱-結構 柱管內(nèi)填充一定的填料，它是“實心”的，簡稱填充柱。 填充氣相色譜柱-柱管材料 優(yōu)點：化學惰性好，

4、柱效高，便于觀察填充情況 缺點：易碎 玻璃 優(yōu)點：耐腐蝕 缺點：不耐高溫高壓 聚四氟乙烯 優(yōu)點：不易破碎，柱壽命長，傳熱性能好 缺點：內(nèi)壁較粗糙，有活性，比較難于清洗干凈 不銹鋼 催化活性太強且易變形，不常用銅管和鋁管 最常用最常用的填充的填充 氣相色譜柱氣相色譜柱 柱管材料柱管材料 填充氣相色譜柱-形狀 螺旋形螺旋形 柱圈徑比柱內(nèi)徑大柱圈徑比柱內(nèi)徑大 15倍，柱圈徑大小倍，柱圈徑大小 會影響柱效會影響柱效 U形柱形柱 易獲得較高柱效易獲得較高柱效 填充氣相色譜柱-固定相 固定相固定相 固體吸附劑固體吸附劑 氣固氣固色譜填充柱色譜填充柱 載體載體+固定液固定液 氣液色譜填充柱氣液色譜填充柱 固

5、定相-固體吸附劑-氣固色譜填充柱 無機吸附劑 定義及分類：強極性的 硅膠、中等極性的氧化 鋁、非極性的碳素及有 吸附作用的分子篩 特點：吸附容量大、熱 穩(wěn)定性好，主要用來分 析永久性氣體和氣態(tài)烴 類混合物 高分子多孔微球 定義及分類：由苯乙烯 與二乙烯苯交聯(lián)共聚的 小球，既是吸附劑又是 載體 特點：吸附活性低，易 獲得對稱色譜峰，對含 羥基的化合物具有相對 低的親和力，機械強度 好，高溫時不流失 化學鍵合固定相 定義及分類：一種以球 形多孔硅膠為基質(zhì)，利 用化學反應把固定液鍵 合于基質(zhì)表面上的鍵合 固體相，分為硅氧烷型、 硅脂型和硅碳型 特點：熱穩(wěn)定性良好， 極性和非極性組分都能 獲得對稱峰，

6、耐溶劑 固定相-載體+固定液-氣液色譜填充柱 在惰性的固體表面涂漬高沸點有機物液膜，以其特殊的性質(zhì)進行分離。 惰性固體載體（擔體） 高沸點有機物固定液 載體的表面涂 固定液 固定相-載體+固定液-載體 主要為多孔徑的固體顆粒，是一種化學惰性物質(zhì) 作用：承載固定液 要求： 比表面積大（多涂漬固定液） 無吸附性（不吸附被測組分） 化學惰性好（不與固定液或樣品發(fā)生反應） 熱穩(wěn)定性好（不分解、不變形、無催化作用） 一定的機械強度（不易破碎） 固定相-載體+固定液-固定液 為高沸點有機化合物，是氣相色譜柱的重要組成部分 要求： 在操作溫度下呈液態(tài)，粘度越低越好（樣品組分在粘度低的固定液中傳質(zhì)速度快， 柱

7、效高，決定了最低使用溫度）； 蒸汽壓低，熱穩(wěn)定性好，可以減少固定液流失（決定了最高使用溫度）； 化學惰性好：不與樣品組分、載體發(fā)生不可逆化學反應； 潤濕性好：利于形成均勻液膜； 選擇性好：能夠分離沸點接近而不同類型的物質(zhì)。 填充氣相填充氣相 色譜柱色譜柱 結構結構“實心實心” 柱管材料柱管材料 玻璃、聚四氟乙烯、玻璃、聚四氟乙烯、 不銹鋼不銹鋼、銅管和鋁管、銅管和鋁管 形狀形狀螺旋形、螺旋形、U形形 固定相固定相 固體吸附劑、載體固體吸附劑、載體+ +固定液固定液 填充氣相色譜柱總結 不銹鋼柱不銹鋼柱 玻璃柱玻璃柱 石英玻璃柱石英玻璃柱 聚四氟乙烯柱聚四氟乙烯柱 柱材料柱材料 氣固吸附色譜柱氣

8、固吸附色譜柱 氣液分配色譜柱氣液分配色譜柱 填充劑及填充劑及 吸附機理吸附機理 非極性非極性 極性極性 手性手性 固定液固定液 化學性能化學性能 填充氣相色譜柱填充氣相色譜柱 毛細管氣相色譜柱毛細管氣相色譜柱 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑 大小和長度大小和長度 氣相色譜柱分類 毛細管氣相毛細管氣相 色譜柱色譜柱 結構結構 柱管材料柱管材料 固定液固定液 分類分類 柱參數(shù)柱參數(shù) 毛細管氣相色譜柱 毛細管氣相色譜柱-結構 主要由兩個部分組成：柱管和固定相 其固定相是附著在柱管的內(nèi)壁上，它是“空心”的，簡稱毛細管柱。 毛細管氣相色譜柱-柱管材料 玻璃、石英玻璃、不銹鋼，使用最為普遍的是玻璃和石英玻璃； 通常在管身表

9、面涂上一層聚酰亞胺作為保護層聚酰亞胺保護層 熔融石英 固定液 基本要求 化學惰性 熱穩(wěn)定性好 內(nèi)表面光滑易潤濕 操作方便 毛細管氣相色譜柱-柱管材料 液體或膠狀 高分子量 具有高熱穩(wěn)定性的聚合物 種類較多 性質(zhì)各異 最常用的是聚硅氧烷和聚乙二醇 毛細管氣相色譜柱-固定液 毛細管氣相色譜柱-固定液 聚硅氧烷： 由許多單個的硅氧烷連接而成； 每個硅原子與兩個功能基團相連，最常見的為甲基 和苯基，此外還有腈丙基和三氟丙基； 功能基團的類型和數(shù)量決定了色譜柱固定相的性質(zhì) 可分為非極性、弱極性和中等極性 100%甲基硅氧烷 非極性 5%-二苯基-95%-二甲基硅氧烷 5%-二苯基-1%-乙烯基-94%-

10、二甲基硅氧烷 弱極性 50%-二苯基-50%-二甲基硅氧烷 14%-氰丙基苯基(7%氰丙基、7%苯基)-86%-二甲基硅氧烷 50%-氰丙基苯基(25%氰丙基、25%苯基)-50%-二甲基硅氧烷 中等極性 毛細管氣相色譜柱-固定液 聚乙二醇： 對極性物質(zhì)有特殊的分離效能 穩(wěn)定性及使用溫度范圍比聚硅氧烷略差 強極性 毛細管氣相色譜柱-固定液 毛細管氣相色譜柱-分類 按柱內(nèi)固定液涂漬方法不同 將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對簡 單，但重現(xiàn)性差、壽命短。 涂壁開管柱 （WCOT柱） 在管內(nèi)壁涂上一層很細的多孔物質(zhì)，再涂固定 液，柱效較WCOT柱高。 載體涂漬開管柱 （SCOT柱） 在管壁上涂敷

11、一層多孔性吸附劑固體微粒，構成 毛細管氣固色譜，分析氣體具有高效、快速、重 復性好的優(yōu)點，可取代填充柱。 多孔層開管柱 （PLOT柱） 將固定液通過化學反應鍵合在管壁上或交聯(lián)在一 起，柱效和柱壽命得到了進一步提高。 化學鍵合或 交聯(lián)柱（最常用） 毛細管氣相色譜柱-柱參數(shù) 這些參數(shù)分 別代表什么 含義呢？ 毛細管氣相色譜柱-柱參數(shù) 柱參 數(shù) 固定液 名稱 柱長 柱內(nèi)徑 固定液 膜厚 柱溫限 柱參數(shù)（一）-固定液名稱 通過固定液名稱可看出色譜柱的固定液是什么 常用不同廠商毛細管柱牌號對照 極性固定液型號 Agilent J&W SupelcoSGEAlltech適用范圍 非極性100%甲基聚硅氧烷

12、 OV-1 SE-30 DB-1 DB-1MS SPB-1BP-1AT-1脂肪烴類化合物 弱極性 5%-二苯基-95%-二 甲基硅氧烷 SE-54 SE-52 DB-5 DB-5MS SPB-5BP-5AT-5 各類弱極性化合 物及各種極性組 分的混合物 中極性 50%苯基的甲基聚 硅氧烷 OV-1701 OV-17 DB-1701SPB-7BP-10 AT-1701 AT-50 極性化合物，如 農(nóng)藥等 強極性聚乙二醇PEG-20MDB-WAX Supelco wax10 BP-20AT-WAX 極性化合物，如 醇類、羧酸酯等 柱參數(shù)（二）-柱長 少于10個組 份的簡單樣 品的快速分 析 短柱

13、 5 12m 1050個組 份樣品的常 規(guī)分析 中長柱 25 30m 大于50個組 份復雜樣品 分析 長柱 50m 柱長短直接影響保留時間和分離效率 分離度與柱長的平方根成正比 加倍柱長，分析時間加倍，但分離度僅增加約40% 塔板理論公式：塔板理論公式： n = L / H 柱參數(shù)（三）-柱內(nèi)徑 0.53mm 替代填充柱用于大體積進樣 適合分析不太復雜的樣品，痕量分析 0.32mm 可以相對兼顧到進樣量和柱效 0.25mm 最常用，用于復雜多組分的樣品分析 0.20mm 多用于快速分析方法中 柱 容 量 柱 效 內(nèi)徑小，塔板數(shù)多，柱效高，但樣品承載容量小，適合做復雜組分內(nèi)徑小，塔板數(shù)多，柱效高

14、，但樣品承載容量小，適合做復雜組分 內(nèi)徑大，塔板數(shù)少，柱效低，樣品承載容量大，適合做簡單樣本的痕量分析，但柱流失嚴重內(nèi)徑大，塔板數(shù)少，柱效低，樣品承載容量大，適合做簡單樣本的痕量分析，但柱流失嚴重 H = A + B/u + Cu 柱參數(shù)（四）-固定液膜厚 0. 10. 2m 薄液膜 高沸點化合物、 半揮發(fā)性成分、 痕量成分 0.250.33m 標準液膜0.55.0m 厚液膜 低沸點化合物、 揮發(fā)性成分 薄膜洗 脫組分 快、峰 分離好、 柱流失 小 厚膜柱容 量大，惰 性高 主要影響主要影響保留時間保留時間和和樣品負載能力樣品負載能力 柱參數(shù)（五）-柱溫限 溫度下限：低于該溫度，固定液粘度太大

15、，傳質(zhì)阻力增 加，不具備分離能力。 溫度上限：恒溫溫度上限和程序升溫溫度上限 恒溫溫度上限：在該溫度下，色譜柱可以較長時間的正 常使用，柱壽命不會受到影響。 程序升溫溫度上限：在該溫度下，色譜柱使用時間不能 過長，否則固定液會裂解、流失，縮短色譜柱的壽命。 低于溫度下限所得低于溫度下限所得 到的色譜峰到的色譜峰- 又圓又寬又圓又寬 溫度溫度 下限下限 恒溫溫恒溫溫 度上限度上限 程序升溫程序升溫 溫度上限溫度上限 思考 這些參數(shù) 分別代表 什么含義 呢？ 標識標識代表的柱參數(shù)代表的柱參數(shù) DB-5固定液名稱 30m30m柱長 0.250mm0.250mm柱內(nèi)徑 1.001.00m液膜厚度 -6

16、0-60溫度下限 325325恒溫溫度上限 350350程序升溫溫度上限 毛細管氣相毛細管氣相 色譜柱色譜柱 結構結構“空心空心” 柱管材料柱管材料玻璃、玻璃、石英玻璃石英玻璃、不銹鋼、不銹鋼 固定液固定液聚硅氧烷、聚乙二醇聚硅氧烷、聚乙二醇 分類分類 涂壁開管柱、載體涂漬開管柱、涂壁開管柱、載體涂漬開管柱、 多孔層開管柱、化學鍵合或交聯(lián)柱多孔層開管柱、化學鍵合或交聯(lián)柱 柱參數(shù)柱參數(shù) 固定液名稱、柱長、固定液名稱、柱長、 柱內(nèi)徑、固定液膜厚、柱溫限柱內(nèi)徑、固定液膜厚、柱溫限 毛細管氣相色譜柱 四、小結與思考 臨床色譜質(zhì)譜檢驗技術 思考題 1 柱柱參數(shù)參數(shù)對應的標識對應的標識 固定液名稱固定液名

17、稱DB-23 柱長柱長20m 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑0.180mm 液膜厚度液膜厚度0.20m 溫度下限溫度下限40 恒溫溫度上限恒溫溫度上限250 程序升溫溫度上限程序升溫溫度上限260 思考題 2 21種脂肪酸混合物，分析時間 25min 色譜圖色譜圖A A 思考題 2 21種脂肪酸混合物，分析時間 9.5min 色譜圖色譜圖B B 色譜柱 1 DB-23，柱長60m，柱內(nèi)徑0.25mm，液膜厚0.15m 色譜柱 2 DB-23，柱長20m，柱內(nèi)徑0.18mm，液膜厚0.20m 思考題 2 思考題 2 21種脂肪酸混合物，保留時間 25min 色譜圖色譜圖A A 色譜柱 1 DB-23，柱長60m，柱內(nèi)徑0.25mm，液膜厚0.15m 思考題 2