PCR擴(kuò)增試驗(yàn)操作步驟

1、、實(shí)驗(yàn)原理PCR是一種選擇性擴(kuò)增 DNA或 RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外dNTP分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈DNA單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的 DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNAPCR反應(yīng)分3步：變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈 DNA退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板 DNA使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)

2、較少。延伸：在DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg+存在的條件下，5宀3的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)，以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2X 1067拷貝。變性退火延伸圖反應(yīng)歷程二、實(shí)驗(yàn)材料1 模板：細(xì)菌 DNA 2 TsgDNA聚合酶 3 dNTP混合液4 10 倍濃度 PCR緩沖液 5 LMgCI2 6 RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97S103 S110 S115 7 提取細(xì)菌 DNA的相關(guān)試劑三、操作步驟1. 細(xì)菌染色體DNA的提取（見上一組

3、）2. RAPD反應(yīng)體系的配置試劑濃度加入量順加序10倍濃度PCR緩沖液樣3 反應(yīng)程序:將RAPD反應(yīng)試劑加入EP管中輕混后用100ul石蠟油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，防止樣品在反復(fù)加熱-冷卻的過(guò)程中蒸發(fā)，蓋好蓋子打開PCR反應(yīng)儀輸入以下反應(yīng)數(shù)據(jù)94攝氏度預(yù)變性5mi n94攝氏度變性40s40攝氏度退火40s72攝氏度延伸1min將EP管放入儀器開始擴(kuò)增，循環(huán)35次；72攝氏度延伸10min儀器為 Model MyGene 25 Plus三、注意事項(xiàng)1、PCR反應(yīng)體系中DNA羊品及各種試劑的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性及全部放入反應(yīng)體系中。2、 為避免污染凡是用在 PCR反應(yīng)中的Tip尖、離心管、蒸餾水都要滅菌；吸每種試劑時(shí) 都要換新的滅菌Tip尖。3、 加試劑時(shí)先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。4、置PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)前，PCRt要蓋緊，否則使液體蒸發(fā)影響PCR反應(yīng)。5. 引物條件 首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)