人臍血間質(zhì)干細(xì)胞一般特性及其多向分化潛能(一)

1、人臍血間質(zhì)干細(xì)胞一般特性及其多向分化潛能 (一)作者：王晶，李志忠，徐茅，遲作華【摘要】【目的】觀察人臍血間質(zhì)干細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞表面分子標(biāo)志 及多向分化潛能?！痉椒ā繌娜四氀蟹蛛x出單個(gè)核貼壁細(xì)胞并進(jìn)行體 外培養(yǎng)。將細(xì)胞以單克隆抗體標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。向培養(yǎng) 細(xì)胞中加入成骨、成軟骨和成脂肪誘導(dǎo)劑，檢測其多向分化能力。 【結(jié) 果】臍血間質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)間為 7 周。流式細(xì)胞分析顯示這些細(xì) 胞 CD29、CD13、CD44 等表達(dá)為陽性，但是它們不表達(dá)造血干細(xì)胞表 面標(biāo)志物。加入成骨誘導(dǎo)劑會導(dǎo)致細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)。采用微球 培養(yǎng)法并加入軟骨誘導(dǎo)劑對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，用阿爾新藍(lán)染色顯示有蛋

2、 白多糖表達(dá)。 在加入成脂誘導(dǎo)劑后， 會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變， 且油紅 O 染色為陽性?！窘Y(jié)論】通過體外傳代培養(yǎng)的方法可以從人臍血單個(gè)核貼 壁細(xì)胞中得到純化的間質(zhì)干細(xì)胞，臍血有望成為間質(zhì)干細(xì)胞的替代來 源。【關(guān)鍵詞】臍血；間質(zhì)干細(xì)胞；分化 臍血中富含造血干細(xì)胞已為人們所熟知，且臍血造血干細(xì)胞移植在臨 床上應(yīng)用已有超過 10 年時(shí)間 1，并已成為繼骨髓之后造血干細(xì)胞移植 的又一重要來源。而對于臍血中是否含有間質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymalstemcells,MSC)這一問題上，學(xué)者們卻一直存在分歧。 Erices等 2的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 從臍血分離的貼壁細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗 原。而 Maresc

3、hi 等 3研究卻顯示，從骨髓中容易分離出間質(zhì)干細(xì)胞， 而臍血中卻不能。而且還有研究發(fā)現(xiàn)臍血中非造血干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì) 胞 4或樹突狀細(xì)胞的表面分子 5 。由此可見，對于臍血中非造血干細(xì) 胞的定性方面，學(xué)術(shù)界仍無最終定論。本實(shí)驗(yàn)擬從臍血中分離并培養(yǎng) 間質(zhì)干細(xì)胞，對其一般生物學(xué)特性進(jìn)行研究，同時(shí)對其進(jìn)行成骨、成 軟骨以及成脂肪等誘導(dǎo)，觀察其多向分化的潛能。1 材料與方法1.1 主要試劑和儀器流式細(xì)胞儀 (Coulter-Elite)，熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體： CD13-PE、CD106-PE、 CD14-PE、CD45-PECY、5CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD54

4、-FITC、 CD49f-FITC、 HLA-DR-FIT(C BDPharmingen)，TGF-1(PEPROTHC)H。1.2 臍血間質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)1.2.1 羥乙基淀粉沉淀法分離臍血間質(zhì)干細(xì)胞無菌條件下采集孕 3341 周順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)胎兒臍血 5080mL，肝素抗凝。孕婦無傳染性疾病， 胎兒無畸形， 并征得家屬及孕婦同意。 將臍血與 6%的羥乙基淀粉 41 比例混勻，室溫靜置 60min，待紅細(xì)胞與血清分界清楚，吸取上清以 400g離心 5min，棄上清，有核細(xì)胞沉淀于管底， PBS洗滌 2 次。1.2.2 臍血間質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)將 DMEM/F12+10%胎牛血清加 入

5、離心管中，吹打制成單細(xì)胞懸液。以 5106/cm2密度接種于 T25 培 養(yǎng)瓶中，置于 37、飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2 孵箱中培養(yǎng)。 5d 首次全量換液，去掉未貼壁的懸浮細(xì)胞。以后每周換液 1 次，待細(xì)胞 長到 80%匯合時(shí)，按照 12 的比例傳代。傳代后每周換液 2次，細(xì)胞 匯合達(dá) 80%時(shí)繼續(xù)按 12 比例傳代培養(yǎng)。1.3 細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測將第 3代細(xì)胞以 0.25%胰酶消化后， PBS洗滌 3 次，制成 1106/mL的 細(xì)胞懸液。將待檢細(xì)胞樣品分為每管 0.1mL，陰性對照管加入鼠 IgG-FITC、 IgG-PE或 IgG-PECY，5 其它管分別加入鼠抗人 CD13-FI

6、TC、CD106-FITC、 CD14-FITC、CD45-PECY、5HLA-DR-FIT、CCD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、 CD54-FITC、CD49f-FITC各 20L，室溫孵育 30min，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù) 5000 10000個(gè)細(xì)胞，儀器自帶軟件分析。1.4 細(xì)胞周期測定取第 3 代細(xì)胞，用 0.25%胰酶室溫消化， PBS洗滌 3 次，棄上清。向離 心管中加入 1mL 預(yù)冷的 70%的酒精，充分吹打制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞 濃度約為 1106/mL。于 4冰箱中固定 24h 后，離心，去上清，沉淀 物重懸在 1mL碘化丙啶染液中（含 RNaseA10g/

7、mL，碘化丙啶 50g/mL）， 4孵育 20min。上流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。1.5 臍血間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基： DMEM/F12， 10%FBS，108mol/L 地塞米松， l0mmol/L? 茁-磷酸甘油和 50mg/L 抗壞血酸。取第 3 代細(xì)胞，以 5 103/cm2密度接種于預(yù)置蓋玻片的 6 孔板內(nèi)。用成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo) 21d 取出蓋玻片進(jìn)行堿性磷酸酶染色（鈣 -鈷法）。1.6 臍血間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基：高糖 DMEM，1FBS，胰島素 6.25 g/m，L 維生 素 C50g/mL，地塞米松 10-8mol/L，10ng/mgTGF-1。將 2.5 105/mL 細(xì)胞加入 15mL離心管內(nèi)， 150g