DNA膠回收中常見問題和解答

1、1、如何計算提取率？1) 回收前樣品中，往往含有非目的 DNA 片段、引物、 dNTP 等，所以不能用測回收前后吸光度的的方法計 算回收率；2) 可將回收前后 DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進行電泳條帶灰度對比；3) 注意，電泳條件及拍攝條件將對灰度對比結果造成很大影響，請仔細操作，以減小誤差。2、如何簡易測算提取率？取膠回收后的 DNA 溶液體積的 1/51/10 ，與等體積的回收前的 DNA 溶液的 5-10 倍稀釋液一起電泳，肉眼 觀察回收后的條帶相對于回收前條帶的亮度，粗略測算回收率(如亮度只有一半時，其回收率可粗略為50% )。3、如何看待提取得率？影響回

2、收率的因素很多，如 DNA 片段大小、點樣量、凝膠種類、電泳緩沖液的緩沖能力、切膠操作、紫外燈 照射強度和時間、溶膠是否徹底等等，所以不能單憑 1-2 次的實驗來判斷其質(zhì)量好壞，最好是多做幾次實驗或用幾 種不同品牌的產(chǎn)品做平行對照實驗，結果相對真實。 ?4、回收率為什么與點樣量和片段大小有關？DNA 片斷越大，和固相基質(zhì)的結合力越強，就越難洗脫，回收率就低； DNA 的量越少，相對損失越大，回收 率越低。5 、用膠回收試劑盒從凝膠中回收 DNA 得率低是什么原因？1 ) 膠塊溶解不完全，可適當延長水浴時間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例；2 ) 膠塊體積太大，應使用槍頭搗碎，還不能充分溶解

3、則先將其切為小塊，分多次回收；3 ) 紫外燈下切膠時間過長，導致 DNA 部分降解，應盡量把切膠時間控制在 30s 以內(nèi)；4 ) 洗滌液使用后未及時蓋嚴瓶蓋，乙醇揮發(fā)，影響回收效率；5 ) TAE 或 TBE 電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導致PH 值升高，降低 DNA 和膜的吸附力，應及時更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好；6 ) 回收前的樣品量太少，加大點樣量；7)洗脫前，預先65 C預熱洗脫液、延長室溫靜置時間、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。6 、加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？1) 膠塊溶解不充分，可再補加一些溶膠液或延長水浴時

4、間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠；2) 膠塊體積過大，應盡量切除多余部分，并將其切為小碎塊，分幾次回收；3) 水浴溫度是否達到規(guī)定溫度 65 C,用溫度計檢測。7 、瓊脂糖凝膠塊不溶？1 ) 瓊脂糖質(zhì)量不好；2) 含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久，使膠塊失水干躁，建議切膠后立即進行回收或?qū)⒛z塊保存于4 C或-20 C;3) 制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。8 、點樣時發(fā)現(xiàn) DNA 樣品有漂出點樣孔外的現(xiàn)象？柱子上的乙醇未完全揮發(fā)干凈，延長室溫下空柱靜置時間以確保乙醇完全揮發(fā)干凈。9、能否使用去離子水洗脫回收？可以，但是實驗室所用去離子水一般PH值偏低，可用NaOH適當調(diào)高PH值，以增加回收得率。1

5、0、能否使用 TE （）洗脫？可以。11、可否使用小于30 pl的洗脫液進行洗脫？不可以。因為說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積。12、關于 DNA 片段大小與回收率的問題？100bp-500bp ， 30-60% ；500bp-4kb ， 80-95% ；4kb 以上， 30-50% 。13、OD值與瓊脂糖凝膠中的 DNA產(chǎn)量不相符？從柱子上洗脫下來的痕量雜質(zhì)增加了A260 的值。14 、吸光度純度測定時應注意哪些問題？ 吸光度測量的是未知樣品與調(diào)零標準之間的相對吸光度，所以請用與洗脫液體相同的液體，對測量樣品進行稀釋和調(diào)零。15、為什么溶膠不徹底會影響回收結果的純度？在電泳過程中， DNA 會與大分子的多糖緊密的結合在一起