總RNA提取及QPCR標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1、總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、儀器試劑Trizol 試劑三氯甲烷（4C預(yù)冷）異丙醇（4C預(yù)冷）75%乙醇（DEPC處理水配置）（4C預(yù)冷）DEPC 處理水 /RNase free water （反轉(zhuǎn)錄試劑盒）無酶 EP 管200 X無酶PCR管冷凍離心機(jī)Nano Drop 2000反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ Takara RR036A ）二、實(shí)驗(yàn)須知1. 選擇人員走動較少的實(shí)驗(yàn)臺或超凈臺（無須打開風(fēng)機(jī)）操作。2. 操作及觀摩人員必須佩戴干凈的一次性手套及口罩。3. 盡可能在冰盤上操作。3. 取EP管時(shí)需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完EP管后，袋子及時(shí)封好。4. Trizol 含劇毒，

2、若濺到皮膚上，請立即用清水沖洗；若濺到眼內(nèi)，立即大量清水沖洗，并 送醫(yī)就診。三、樣品處理1. 組織樣品 將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol溶液，混勻，室溫放置5min 使其充分裂解。注1:樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。注2:組織樣品收取后應(yīng)立即處理或液氮冷凍并-80攝氏度保藏。胰腺組織樣品因其各種酶含量極其豐富，應(yīng)尤為注意，研磨過程中注意保持樣品低溫狀態(tài)。2. 貼壁細(xì)胞樣品棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，根據(jù)下表加入適量 Trizol溶液，吹打混勻，并吸至 無酶EP管中，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。培養(yǎng)皿Trizol體積皿（6孔板）1mL

3、6cm皿3mL10cm 皿10mL注：加入Trizol溶液后，可將培養(yǎng)皿放入-80 C冰箱，20min后取出化開，通過凍融增加細(xì)胞 裂解效果。3. 懸浮細(xì)胞500g x 5min離心收集細(xì)胞， 棄去培養(yǎng)基，約5-10 x 106細(xì)胞加入ImLTrizol溶液，吹打混勻, 室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。注：某些酵母或細(xì)菌細(xì)胞須超聲裂解。4. 注意事項(xiàng)1） 樣品裂解液可室溫存放數(shù)小時(shí)，-80 C可至少存放一月。2）若樣品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物質(zhì)，如脂肪、肌肉或塊莖植物等樣品，可增加 一步離心操作，具體步驟如下：12000g、4 C離心10min，胞外基質(zhì)、多糖、高分子量DNA將會形成顆

4、粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂樣品會在上清液上方形成一層脂肪層。（2D移除脂肪層，將澄清的上清液移至新的無酶EP管中。四、總RNA提取1. 每1mL Trizol溶液加入200丄三氯甲烷，立即蓋上蓋子，劇烈振蕩 15s,使水相和有機(jī)相 充分接觸，室溫靜置 3-5min。2. 4C下，12000g離心15min，液體分為三層，RNA位于上層水相，約占總體積的 50%，移至新無酶EP管中（用20-200此的槍吸取上清，吸上清時(shí)， EP管傾斜大約45度，槍頭應(yīng)沿 著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）。3. 加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次，不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜

5、置10min。4C下，12,000g離心10min，可見羽毛狀白色 RNA沉淀，小心吸出上清。4. 1mL 75%乙醇洗滌兩次（4 C 7500g離心5min，加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不可使用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀）。注：RNA可與75%乙醇中4C保存一周，-80C保存一年。5. 室溫干燥室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。視沉淀量加入適量 DEPC水（至少15 L）溶解沉淀，使用 Nano Drop測定RNA濃度。6. 首次提取RNA時(shí)須跑膠驗(yàn)證 RNA質(zhì)量，核酸膠配置為：1%瓊脂糖/1 X TAE緩沖液，取5止RNA溶液混上 丄Loadin

6、g Buffer，上樣跑膠，電泳大概 15min，凝膠成像儀上觀察 RNA條帶質(zhì)量，RNA條帶一般為三條，理想的 RNA條帶為：明亮的28S條帶與18S條帶，并且 28S條帶亮度大約為18S條帶兩倍，微弱或沒有 5S條帶。五、反轉(zhuǎn)錄 用Prime Script TM 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR036A）將總 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。1. 于200譏無酶PCR管中按反應(yīng)體系配置 RT液。反應(yīng)體系如下:試劑使用量終濃度5 xPrime Script RT Master Mix ( Perfect Real Time)2 L1 x總RNA500ngDEPC處理水補(bǔ)足至10 L2.輕柔混勻后進(jìn)行

7、反轉(zhuǎn)錄應(yīng)，條件如下:37C 15mi n （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 C 5sec （反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）4C3.得到的RT反應(yīng)液使用 Nano Drop測定cDNA濃度，-20C保存。QPCR 標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、QPCR 原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí) 時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行絕對定量分析或通過內(nèi)參對比進(jìn) 行相對定量分析的方法。本實(shí)驗(yàn)室常采用相對定量進(jìn)行分析。1. SYBR Green ：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性結(jié)合 DNA雙鏈，發(fā) 出熒光信號，而游離 SYBR 染料分

8、子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。2. Ct 值Ct 值( Cycle threshold ，循環(huán)閾值)的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所 經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。1) 熒光閾值( threshold )的設(shè)定PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號， 熒光閾值的缺省 (默認(rèn))設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 x SD cycle 3-15。2) Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下：Ct=-1/lg(1+e) lgXx0+

9、lgN/lg(1+e)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，e為擴(kuò)增效率，常默認(rèn)為1, N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。二、儀器試劑SYBR Green PCR Master Mix引物ddH20cDNA模板EP管96孔板迷你離心機(jī) 7200RPM （TOMOS TMC15287 ）離心機(jī)（湘儀 L530）QPCR 儀（伯樂 Q200）三、QPCR操作步驟1. QPCR每孔體系如下：試劑使用量cDNA模板10pg-100 ngSYBR Green PCR Master Mix10 L上游引物1 (iL下游引物1 (iLddH2O補(bǔ)足至20 L根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算所需體系 預(yù)混液體積

10、（預(yù)混液中不包含 cDNA模板），并按組分比例配置, 振蕩器振蕩或用槍吹打均勻，迷你離心機(jī)快速離心去除氣泡。cDNA模板根據(jù)使用量用ddH2O稀釋到合適的濃度。例如：兩組樣品：對照組、處理組，每組樣品三個(gè)樣，檢測目的基因表達(dá)量，綠色部分表示檢測內(nèi)參基因表達(dá)量，藍(lán)色部分表示檢測目的基因表達(dá)量，96孔板設(shè)置如下：1234567891011A對照組1對照組1對照組1對照組1對照組1對照組1B對照組2對照組2對照組2對照組2對照組2對照組2C對照組3對照組3對照組3對照組3對照組3對照組3D處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1處理組1E處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2處理組2F處理組3處理

11、組3處理組3處理組3處理組3處理組3GH1）樣品全都稀釋至50 ng/ L模板量采用100 ng,即每孔須加樣2卩1。2）預(yù)混液1 :內(nèi)參基因18個(gè)孔,我們配置20個(gè)孔體系，即200 LSYBR Green PCR Master Mix,20譏內(nèi)參基因上游引物，20 X內(nèi)參基因下游引物，ddH2O120卩L預(yù)混液2 :目的基因18個(gè)孔，我們配置20個(gè)孔體系，即200卩L SYBR Green PCR Master Mix20譏目的基因上游引物，20譏目的基因下游引物，ddH2O120卩L注：配置預(yù)混液時(shí)須適當(dāng)多配，EP管及槍頭易附著預(yù)混液引起損失，例如 18個(gè)孔可配置 20-22孔的預(yù)混液。3

12、）根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將預(yù)混液加入孔內(nèi)，同一預(yù)混液不需換槍頭，注意不要將槍打到 第二檔，避免產(chǎn)生氣泡。4）根據(jù)96孔板設(shè)置，分別將樣品加入孔內(nèi)，每一孔都必須換槍頭，避免交叉污染。96孔板貼緊，避免交叉污染，離封上封口膜，用硬卡片左右上下來回刮幾下，使封口膜與心機(jī)1500g x 2min離心。3. 上QPCR儀進(jìn)行反應(yīng)分析，反應(yīng)程序如下Step 1 95 C30secStep 2 95 C5 secStep3 60 C30sec設(shè)置Step2-3 39個(gè)循環(huán)Step4添加溶解曲線注：該反應(yīng)程序僅是一般性建議，如有需要請根據(jù)具體情況優(yōu)化。4.數(shù)據(jù)導(dǎo)出，進(jìn)行定量分析。相對定量分析舉例如下:內(nèi)參(Ct)基因(Ct) Ct Ct2- Ct對照組處理組1處理組2第一步計(jì)算 Ct=基因Ct值-內(nèi)參Ct值第二步計(jì)算 Ct=處理組 Ct-對照組 Ct第三步計(jì)算2-Ct最后結(jié)果對照是1,處理小于1,說明該基因表達(dá)下調(diào)。注：相對定量計(jì)算